DNA的PCR擴增是PCR是聚合酶鏈反應。該反應是根據DNA變性，復性原理設計的。
基本介紹
- 中文名：DNA的PCR擴增
- 學科：生物學
- 性質：名詞
- 特點：需要反應
Ⅰ.基本概念,Ⅱ.反應步驟,Ⅲ.DNA的變性與復性,變性,復性,
Ⅰ.基本概念
反應系統中包括含目的基因的微量樣品，耐熱的DNA聚合酶，4種dNTP（脫氧核苷酸）以及兩種過量的引物。引物一般長20-30bp（可以用人工合成）。
Ⅱ.反應步驟
該反應分三步進行：
a.DNA模板（目的基因和引物）高溫度變性（95°C） 使之解鏈。
b.降溫復性（40°C-60°C），使目的基因與引物雜交。
c.在70°C-75°C的溫度下，DNA聚合酶進行酶促聚合反應，使目的基因DNA序列在3’位置上逐漸延伸。新合成的引物延伸鏈又可以作為下一步反應的模板，如此反覆循環進行，按照2^n的指數擴增，短時間內可獲得大量的DNA目的基因。
Ⅲ.DNA的變性與復性
DNA的PCR擴增是根據DNA變性，復性原理設計的，變性與復性的簡介如下。
變性
DNA變性是指核酸雙螺旋鹼基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構象和性質發生改變。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，鹼基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醯胺等，均可引起核酸分子變性。
變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變： 1）溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構，變性後代之以柔軟而鬆散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。? 2）溶液旋光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變，使DNA溶液的旋光性發生變化。 3）增色效應(hyperchromic effect)。指變性後DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子中鹼基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中鹼基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，於是鹼基外露，鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收，故而產生增色效應。
復性
DNA的復性指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為" 退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡要說明之。
變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特徵可以基本恢復到第一次變性曲線的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動顯著減弱互補鏈結合的機會自然大大減少。從熱運動的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利於復性。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。
