dna提取

DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超音波法、研磨法、凍融法。化學方式如異硫氰酸胍法、鹼裂解法。生物方式：酶法。根據核酸分離純化方式的不同有矽質材料、陰離子交換樹脂等。

基本介紹

• 中文名：dna提取
• 主要方法：CTAB方法
• 物理方式：玻璃珠法、超音波法等
• 化學方式：異硫氰酸胍法、鹼裂解法等

主要分類

真核生物DNA、細菌DNA、病毒DNA、質粒DNA、細胞懸液DNA、組織DNA。

雙鏈環狀、雙鏈線性、單鏈環狀

細胞核DNA、細胞器DNA

提取原則

1.保證核酸一級結構的完整性；

2.核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

3.其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；

4.其他核酸分子，如RNA，也應儘量去除。

樣品準備

生物組織

一.最好新鮮組織，若不能馬上提取，應貯存-70℃或液氮

二.液氮冷凍敲碎研磨

三.組織勻漿法

四.液氮勻漿法

培養細胞

懸浮生長細胞：1500g離心，4℃10分種收集細胞

單層培養細胞：可用刮棒或胰酶消化後離心收集

血液樣品

血液樣品一.血液抗凝易用檸檬酸抗凝液（ACD）：檸檬酸0.48g；檸檬酸鈉1.32g；右旋葡萄糖1.47g加H2O至100ml，每6ml新鮮血液加1mlACD液零度保存數天，-70度長期貯存。

提取方法

一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯萃取，高速離心後取上清，所得DNA大小為100-150kb

二.甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

四.異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

五.表面活性劑快速製備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

六.加熱法快速製備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

七.鹼變性快速製備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。

濃縮

一.固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。

二.丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重複幾次可顯著減少DNA體積。

三.乙醇或異丙醇沉澱：（1）需要陽離子鹽的存在，NaAc最常用,NaCl對含SDS樣品好，NH4Ac去除dNTP好。PiCl沉澱RNA好，但不能用於反轉錄前。（2）沉澱溫度與時間；0℃一4℃，12000g，10分鐘，小於100bp DNA需超速離心。

四.精胺沉澱法：與DNA結合後使DNA結構凝縮沉澱，需在無鹽或低鹽溶液。

鑑定

分光光度法

在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收，A₂₆₀與A₂₈₀之比應在1.75-1.80之間。低於此值表明製備物中殘留蛋白質成分較高或含有酚，高於此值表明有RNA的殘留。

凝膠電泳分析

影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構象：a.相同分子量的超螺旋環狀（Ⅰ型），切口環狀（Ⅱ型），線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠。b.一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④電壓：遷移率與所加電壓成正比，但是電壓過大有效分離範圍減小。⑤電場方向：單一方向速率均等，改變方向，極大分子DNA遷移更慢。通過脈衝電場凝膠電泳分離極大DNA。

檢測

溴乙錠染色

在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠。

銀染法

Ag⁺與DNA形成複合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。

分析

通常與已知分子量的標準DNA片段一起電泳，經比較可獲知DNA標本大小。如條帶拖尾，系加入DNA量太多或凝膠未制好。若DNA分子量小或一片模糊，表明DNA有降解。

回收

電泳到DEAE－纖維素膜

在所需條帶前插入DEAE－纖維素膜，繼續電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。

透析袋電洗脫

切下條帶的瓊脂糖放透析袋內，加緩衝液後繼續電泳，DNA出膠後回收。

低熔點瓊脂糖凝膠

切下膠，加熱熔化膠，然後用酚抽提回收DNA。

定量

分光光度法

測定DNA在A₂₆₀的光吸收，計算濃度。雙鏈DNA：A₂₆₀*稀釋倍數*50（ug/ml）單鏈DNA：A₂₆₀*稀釋倍數*40（ug/ml）單鏈核苷酸DNA：A₂₆₀*稀釋倍數*20（ug/ml）.

瓊脂糖平板法

在含溴乙錠的瓊脂糖平板上滴1-5ul樣品DNA和已知濃度標準品，放置數小時後檢測。

微型凝膠電泳

將樣品和標準品同時電泳，染色，比較螢光強度。

貯存

短期儲存

4℃或-20℃存放於TE緩衝液中。

長期貯存

在70%乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。