《ClC-7參與牙發生的分子機制研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由段小紅擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：ClC-7參與牙發生的分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：段小紅
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
在前期臨床實踐中，我們收集了由於氯離子通道7（ClC-7）基因突變引起的三個骨硬化症家系，觀察到三位先證者出現了牙萌出異常、牙根發育不全、前後牙表型不同等特徵，同時基因型與臨床表型存在劑量效應關係。結合課題組前期氯通道的研究基礎，我們提出ClC-7是影響牙發生和牙根發育的重要分子。本項目將通過siRNA、腎被膜下牙胚細胞移植實驗、牙囊細胞的體外培養、ES細胞的體外誘導、chitosan修飾siRNA及體內注射、CLCN7 RNA剪接實驗等多個實驗或方法驗證ClC-7通過影響破骨細胞、和/或牙囊細胞的生物學功能，進一步影響牙萌出通道的形成以及牙根的形成，RNA剪接的變化可能是造成CLCN7基因功能變化的核心因素，其組織學的差異性調控也是造成臨床表現變化的重要原因。本研究的意義在於結合前期臨床發現的問題以及在已有的實驗基礎提出科學問題，闡述ClC-7新的生物學功能及其致病的機理。
結題摘要
ClC-7 是電壓門控氯通道（voltage-gated chloride channel, ClC）家族的一個重要成員，人ClC-7的編碼基因是CLCN7，定位於16p13.3，CLCN7 突變可以引起三種類型的骨硬化症，這些類型的骨硬化症患者伴隨有不同類型的牙發育異常。本項目通過家系調查、臨床樣本收集、小鼠體內外實驗等，表明ClC-7是參與牙發育、牙萌出和牙根形成的重要分子。臨床研究方面，我們先後收集了來自4個家庭的5例骨硬化症患者，臨床表現為不同類型的骨硬化症特徵，但其均無一例外地伴隨牙萌出異常、牙根發育不全等特徵，同時基因型與臨床表型存在劑量效應關係。隨後通過RT-PCR、免疫組織化學染色、原位雜交等多種方法，驗證ClC-7在牙胚發育過程中以及牙相關細胞的表達。在Clcn7基因局部敲除實驗中，將CS-siRNA-Clcn7納米粒溶液局部注射於牙胚，通過顯微CT和石蠟切片HE染色，觀察牙齒髮育不同時期，牙胚中各結構，如成釉細胞，成牙本質細胞，牙釉質和牙本質的形成和變化規律，結果發現，不同時間點的實驗組表現出異常發育的牙組織、部分區域的牙釉質、牙本質、牙髓已失去正常結構特徵以及牙根發育異常；Micro-CT的結果顯示實驗組小鼠牙不萌出或部分萌出。牙胚經Clcn7 shRNA慢病毒處理，然後行腎被膜下移植，移植後不同時間採用多種方法觀察牙的形成和細微結構。石蠟切片H&E染色及AZON染色結果顯示，實驗組部分前期牙本質變寬，牙根彎曲，牙周組織中正常的牙周韌帶、牙骨質及牙槽骨消失，充滿了排列紊亂的成纖維細胞，micro-CT掃描結果顯示實驗組牙畸形，牙根彎曲或變短，牙尖結構不明顯。系列體外細胞實驗表明：Clcn7 siRNA對體外培養的成釉細胞系和成牙本質細胞系的影響較小，主要表現為對牙囊細胞（DFCs）的影響，如DFCs中ClC-7表達水平的降低導致成骨相關功能分子和RANK-RANKL-OPG信號軸表達水平的改變。DFCs和單核細胞共培養實驗，表明DFCs可以促進破骨細胞的分化，降低DFCs的ClC-7表達水平導致破骨細胞數目減少及其骨質吸收功能降低。通過以上綜合實驗，表明ClC-7通過影響破骨細胞和牙囊細胞的生物學功能，進一步影響牙萌出通道的形成以及牙根的形成。
