《Ca2+ —CaMKs介導的電刺激促軸突生長作用及機制研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由胡學昱擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：Ca2+ —CaMKs介導的電刺激促軸突生長作用及機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：胡學昱
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
周圍神經缺損治療是仍未解決的世界性難題。電刺激（electrical stimulation，ES）能夠促進軸突生長，加速神經再生，但作用機制至今尚未明確。我們前期研究發現，電刺激能夠促進背根神經節軸突生長，增加細胞內鈣離子（Ca2+）濃度，且二者具有相關性。本項目擬套用前期建立的體外細胞電刺激模型，通過檢測不同電刺激參數對軸突生長的影響，篩選最佳刺激參數，最佳化電刺激模型；進而套用藥理學方法，從細胞外鈣內流和細胞內鈣庫釋放兩方面，研究電刺激促軸突生長過程中，升高的細胞內鈣離子主要來源；選取鈣調蛋白激酶（CaMKs）為對象，套用其相應的抑制劑，確定參與ES促軸突生長的CaMKs類型， siRNA技術進行驗證，並對其下游信號通路中的關鍵組分（如CREB等）展開研究，探討Ca2+-CaMKs介導的電刺激促軸突生長的可能機制，為電刺激套用於臨床神經損傷修復提供必要的實驗數據和理論支持。
結題摘要
本項目基本按照項目任務書研究內容及計畫完成。 周圍神經缺損治療是仍未解決的世界性難題。大量文獻報導和我們前期研究發現，電刺激能夠促進軸突生長，加速神經再生。我們進一步的研究發現，電刺激能夠促進背根神經節軸突生長，增加細胞內鈣離子濃度，且二者具有相關性，但具體作用機制尚不清楚。 為此，本項目在體外原代培養背根神經節神經元的基礎上，構建體外細胞-電刺激模型，全面篩選可有效促進神經元突起生長的電刺激參數，並研究可能參與此過程的關鍵分子及信號通路，為深入理解電刺激促周圍神經再生的分子機理提供新的實驗依據和理論基礎。 主要的研究結果：（1）使用無血清Neurobasal/B27培養基、低密度體外原代培養背根神經節神經元，純度可達到(92±6)%；（2）從雙/單相、刺激時間、刺激電壓、刺激頻率這四個方面對神經元進行電刺激干預，免疫細胞化學染色後，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟體測量突起長度，篩選出可有效促進突起生長的電刺激參數如下：雙相電、刺激30min、電壓5V、頻率10Hz；（3）利用雷射共聚焦/鈣成像技術結合藥理學實驗觀察到，電刺激作用下神經元胞內鈣離子水平上升，並確定了胞內增加的鈣離子來源於兩個途徑：① L、N型電壓依賴性鈣通道（L-VDCC、N-VDCC）參與鈣離子從胞外向胞內的轉運；② 三磷酸肌醇受體（IP3R）鈣庫和斯里蘭卡肉桂鹼受體（RyR）鈣庫參與胞內鈣動員過程；（4）通過阻斷鈣離子來源並從分子和mRNA水平，觀察到電刺激過程中神經元突起再生加快，神經元表達c-fos、BDNF增加且呈現明顯的鈣依賴性；（5）在電刺激作用下，抑制鈣-鈣調蛋白依賴的蛋白激酶（CaMKs）後，神經元中磷酸化的環磷酸腺苷-反應元件結合蛋白（pCREB）、c-fos、BDNF表達下降，並出現電刺激促進突起再生作用減弱，說明CaMKs參與電刺激增強神經元中pCREB、c-fos、BDNF的表達，並參與電刺激促進神經元突起再生。 上述研究結果表明，在適宜的電刺激作用下，通過L-VDCC、N-VDCC、IP3R鈣庫和RyR鈣庫等多重途徑使神經元胞內鈣離子水平上升，胞內增加的鈣離子使CaMKs活性增強，進而增強了CREB的磷酸化程度，pCREB作用於靶點基因c-fos和BDNF，加強二者轉錄和翻譯，使神經元表達c-fos和BDNF上調，從而達到促進神經元突起再生。
