《CRISPR靶向調控HDAC9在骨髓基質幹細胞治療股骨頭壞死的作用》是依託華中科技大學，由馮勇擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：CRISPR靶向調控HDAC9在骨髓基質幹細胞治療股骨頭壞死的作用
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮勇
- 依託單位：華中科技大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
多向分化潛能的骨髓基質幹細胞（MSCs）被認為是股骨頭壞死發病機制的中心環節及治療的關鍵靶點。股骨頭壞死的自體MSCs成骨成血管分化潛能顯著下降，制約其治療骨壞死的臨床療效。新近研究表明HDAC9不僅是開啟MSCs成骨成脂肪分化調節關鍵因素，還具有靶向調節成血管的重要功能。成骨偶聯成血管過程一直被認為是調控MSCs分化的難點，因此HDAC9對MSCs成骨偶聯成血管調控有望成為股骨頭壞死防治研究新的突破點。最新的基因編輯技術CRISPR能精確制導靶基因的定點敲除和靶向修飾。本研究擬通過已建立的激素性股骨頭壞死模型，利用已掌握的CRISPR技術定點敲除和靶向激活修飾系統定位雙向調控HDAC9，以期修復MSCs成骨偶聯成血管的分化缺陷，並驗證修飾後MSCs移植治療骨壞死的療效，從而深入探討HDAC9在股骨頭壞死中的作用機制，為防治股骨頭壞死提供理論基礎和新的治療策略。
結題摘要
本研究擬探討激素性股骨頭壞死的發病機制，通過已掌握的CRISPR技術靶向敲除HDAC9並利用慢病毒感染MSCs，觀察HDAC9下調後對骨髓間充質幹細胞成骨偶聯成血管分化的影響。我們收集了激素性與非激素性股骨頭壞死來源患者的股骨近端骨髓，成功培養出了MSCs，利用RT-PCR分別檢測兩組來源MSCs的HDAC9其mRNA表達。我們利用CRISPR技術靶向敲除HDAC9，並利用慢病毒作為載體成功感染MSCs，採用RT-PCR及Western Blot技術檢測HDAC9含量，驗證是否下調成功。我們採用MTT檢測其增殖能力、採用流式細胞學檢測其凋亡功能；我們對敲除HDAC9的MSCs分別進行成骨、成血管、成脂肪誘導分化培養，採用茜素紅染色、血管形成實驗以及油紅O染色觀察其分化能力，也通過RT-PCR及Western Blot檢測成骨相關基因Runx2、OCN，成血管相關基因PDGF-BB、CD31，成脂肪相關基因PPARγ的表達。同時，為了進一步探究HDAC9通過何種方式影響MSCs成血管分化，我們也採用RT-PCR檢測了miR17-92簇表達水平變化。最後，為了探究HDAC9基因下調對相關基因表達的影響，我們採用Affymetrix表達譜晶片進行相關檢測，並利用生物信息學的方法進行功能富集分析。此外，我們還成功構建兔激素性股骨頭壞死的模型，並將HDAC9的CRISPR激活系統修飾MSCs，通過骨髓回輸移植。結果顯示SONFH來源的MSCs 其HDAC9的表達顯著降低。利用CRISPR技術靶向敲除HDAC9並通過慢病毒感染MSCs後，HDAC9的表達顯著降低，表明我們成功構建HDAC9下調的MSCs。MTT檢測及流式細胞學分析結果提示HDAC9敲低後不會影響MSCs的增殖與凋亡。HDAC9敲低將會導致MSCs的成骨偶聯成血管分化能力降低，成脂分化能力增強。另外，HDAC9敲低後可使hsa-miR-17-5p、hsa-mir-92-1表達顯著升高，hsa-miR-20a、hsa-miR-19b-1表達降低。Affymetrix表達譜晶片檢測提示HDAC9下調後，共有2557基因表達發生改變。生物信息學分析發現HDAC9下調後差異基因主要參與DNA複製、核小體裝配、組蛋白偶聯以及NOD-like receptor、TNF信號通路。動物模型提示骨髓回輸移植治療效果不佳。本研究利用
