C型肝炎病毒核糖核酸測定試劑技術審查指導原則

為加強醫療器械產品註冊工作的監督和指導，進一步提高註冊審查質量，國家食品藥品監督管理總局組織制定了C型肝炎病毒核糖核酸測定試劑

本指導原則旨在指導註冊申請人對C型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)測定試劑註冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評註冊申報資料提供參考。

本指導原則是對C型肝炎病毒核糖核酸測定試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，並依據產品的具體特性對註冊申報資料的內容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則未包含的研究內容，可自行補充。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導檔案，不涉及註冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以採用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

基本介紹

• 中文名：C型肝炎病毒核糖核酸測定試劑技術審查指導原則
• 發文時間：2015年11月16日
• 發文機關：國家食品藥品監督管理部門
• 發文號：2015年第93號

範圍

（一）臨床背景

C型肝炎是一種主要經血液傳播的疾病，C型肝炎病毒慢性感染可導致肝臟慢性炎症壞死和纖維化，部分患者可發展為肝硬化甚至肝細胞癌，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛生問題。

（二）C型肝炎感染分布

C型肝炎呈全球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。據世界衛生組織統計（2014），全球約1.85億人感染HCV，其中約1.5億為慢性感染，每年有35萬～50萬人死於C肝併發症，每年新發感染病例約300萬～400萬例。
HCV1b和2a基因型在我國較為常見，其中以1b型為主；某些地區有1a、2b和3b型報導；6型主要見於香港和澳門地區，在南方邊境省份也可見此基因型。

（三）HCV特點

HCV屬於黃病毒科(flaviviridae)，其基因組為單股正鏈RNA，易變異，目前可分為6個基因型及50多種不同亞型，按照國際通行的方法，以阿拉伯數字表示HCV基因型，以小寫的英文字母表示基因亞型(如1a、2b、3c等)。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上。

HCV基因組含有一個開放讀框(openreadingframe,ORF)，編碼10餘種結構和非結構(NS)蛋白，NS3蛋白是一種多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶，為HCV複製所必需，是抗病毒治療的重要靶位，其末端具有核苷酸轉移酶活性，但由於RNA酶缺乏矯正功能不能修正錯配，多次複製後易導致HCV多種變異產生。

（四）HCVRNA定量檢測

HCVRNA定量檢測方法包括實時螢光逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-polymerasechainreaction，qRT-PCR)、分枝DNA(bDNA)等。本指導原則所指的HCVRNA測定試劑是指利用qRT-PCR方法的核酸檢測技術，以HCV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HCVRNA進行體外定量檢測的試劑，可作為HCV現症感染的證據和抗病毒療效評估的觀察指標。

其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導原則，但應根據產品特性確定其中具體內容是否適用，如不適用，應另行選擇符合自身方法學特性的技術要求或評價方法。本指導原則適用於進行首次註冊申報和相關許可事項變更的產品。

本指導原則不適用於按照藥品管理的用於血源篩查用途的HCVRNA檢測試劑。

基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他等內容，其中其他包括同類產品在國內外批准上市的情況，應著重從方法學及檢出限等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批准的同類產品之間的主要區別。應符合《體外診斷試劑註冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）和《體外診斷試劑註冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料的研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、酶、標準品或企業參考品等的選擇與來源、製備過程、質量分析和質控標準等的相關研究資料。如主要原材料為企業自己生產，其生產工藝應穩定；如主要原材料源於外購，應提供的資料包括：選擇該原材料的依據及對比試驗資料、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨後的質量檢驗資料。主要原材料的研究資料如下：

1.企業內部參考品:應詳細說明有關企業內部參考品的原料選擇、製備、定值過程等試驗資料。建議優先選擇不同型別的臨床陽性樣本製備內部參考品以直接反映臨床實際情況並起到質控的作用；企業也可選擇假病毒如蛋白包裹RNA（armoredRNA）作為內部參考品，假病毒的優點是易製備、型別全且無生物安全性風險，但不像臨床樣本可以完整反應實際的檢測效能。建議企業內部參考品應覆蓋1～6型，其中至少包括1、2、3型別的臨床陽性樣本，各型別參考品在同一濃度水平應有多份。

陽性參考品：每個型別設定三個梯度並儘量覆蓋線性範圍，陽性參考品的亞型以及濃度需經過可靠方法進行確認。

陰性參考品：可採用經確認無HCV感染的臨床樣本，還應考慮納入其他近似病原體（B型肝炎病毒，hepatitisBvirus，HBV；人類免疫缺陷病毒，humanimmunodeficiencyvirus，HIV等）感染樣本。

檢測限參考品：檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品。在進行最低檢測限性能評估時，應設定多個梯度，從擴增反應終體系核酸濃度進行評價，建議採用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。當設定檢測限參考品時，可以僅設定一個濃度水平，該水平可略高於95%的陽性檢出率水平，而設定為100%檢出，應明確參考品中靶核酸的濃度水平。

精密度參考品：精密度參考品原料要求同陽性參考品，應對弱陽性、中或強陽性水平的精密度進行驗證；如有必要，建議同時設定陰性參考品對精密度進行驗證。

2.試劑盒內對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設定各種試劑盒對照品來實現，質控體系需考慮對樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結果進行合理的質量控制。對照品可採用人血清（血漿）或假病毒進行配製。申報資料應對試劑盒對照品有關原料選擇、製備、定值過程等試驗資料詳細說明。HCVRNA定量檢測試劑的質控品應至少設定三個量級水平的系列質控品:弱陽性質控品、強陽性質控品和陰性質控品。校準品和質控品均應參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。企業應對各質控品的濃度範圍作出明確的範圍要求。

試劑盒質控體系主要考慮以下幾方面：

陽性對照品（質控品）

建議對每次檢測樣品反應管設定強陽性對照品（質控品）及弱陽性對照品，陽性對照品應參與樣本核酸的平行提取，以對樣本核酸分離/純化、試劑及儀器性能、擴增反應過程等環節進行質量控制，企業應對各陽性對照品（質控品）的濃度範圍做出明確要求。如，可採用陰性人血漿+假病毒製備，應使用權威方法確認陰性人血漿的生物安全性及無干擾性：抗-HCV、抗-HIV1/2、HBsAg等檢測陰性，HCVRNA等檢測陰性。

陰性對照（質控品）：

建議對每次檢測樣品反應管設定陰性對照（質控品），陰性對照品應參與樣本核酸的平行提取,以對可能存在的交叉污染產生的假陽性結果進行質控。可採用陰性人血漿製備，應使用權威方法確認陰性人血漿的生物安全性及無干擾性，

3.校準品：基質應採用人血清或血漿，並能溯源至國際/國家標準物質，單位應使用IU/ml表示。提交完整溯源性檔案，可參照GB/T21415-2008《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》進行。

4.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

5.聚合酶鏈反應（PCR）組分的主要材料（包括引物、探針、內標、各種酶及其他主要原料）的選擇、製備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

5.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，對純度、濃度、保存穩定性等的詳細驗證資料。

5.2引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，合成後經聚丙烯醯胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，如為自製，應包括對序列準確性、純度、穩定性、功能性實驗等方面的驗證。如為外購，應提供合成機構出具的包括如上性能的質檢證明，如聚丙烯醯胺凝膠電泳法（PAGE）結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

5.3探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用於特定核酸序列的探測。合成後經PAEG或其他適宜方法純化，在5'-端標記螢光素報告基團或其他發游標記物，在3'-端標記螢光素淬滅基團，並經HPLC或其他適宜方法純化,純度應達到高效液相色譜純。如為外購，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明(HPLC分析圖譜)；應對探針的核酸序列及標記的螢光素或化學發光物進行核實，並作HPLC分析。

5.4RT-PCR反應所需酶

通常包括以下幾種活性：①RNA依賴的DNA聚合酶活性:以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。②核糖核酸酶H（RNaseH）活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA依賴的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。④熱穩定性。

為了減少過程中產物污染，建議試劑盒組成體系增加降解反應產物的體系，如尿嘧啶糖基化酶（UNG）等，應對酶活性有合理驗證，應提供有關保存穩定性、活性及功能性實驗等的研究資料。

6.內對照（內標）的原料選擇、製備、定值過程及試驗資料。申請人應對內標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，內標設定應合理，內標值應在一定範圍內設定上下限範圍且閾值循環數（Ct）值不受靶序列的明顯影響；通常選擇假病毒,因不能反映提取問題，內標不應使用裸露RNA。

（三）主要工藝及反應體系的研究資料

基本生產工藝主要包括：配製工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配製工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配製過程應對pH、電導率等關鍵參數進行有效控制。

生產工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、穩定性和有效期提供確切的依據，主要包括以下內容：

1.主要生產工藝介紹，套用流程圖方式表示，並標明關鍵工藝質控步驟。

2.反應原理介紹。

3.基因位點選擇、PCR方法學特性介紹。

4.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應體積等，加樣量和反應體積參考相應行業標準，經研究驗證後確定。

5.確定PCR各階段溫度、時間及循環數的研究資料。

6.對於基線閾值（threshold）和Ct值確定的研究資料。

7.不同適用機型的反應條件的對比分析，如果有差異應分別詳述，並提供驗證資料證明差異性對試驗結果的影響。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交生產者在產品研製後，在實際生產條件下連續生產三批並對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，對於每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資訊。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。分析性能評價的實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批准指南（CLSI-EP）檔案或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。對於HCVRNA測定試劑，建議著重對以下分析性能進行研究：

1.HCVRNA提取純化

由於RNA酶的廣泛存在，血樣的保存運輸以及RNA的提取純化均應注意避免RNA酶的污染。

病毒RNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關鍵環節。因此，無論申報產品是否含有RNA分離/純化的組分，企業都應對核酸提取的環節做詳細的驗證。臨床標本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對於RNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的RNA外，還應有純化步驟（如磁珠提取法），儘可能去除PCR抑制物，避免使用無純化步驟的簡易方法。

申請人應結合申報產品的特性，合理選擇最佳化RNA分離/純化試劑，建議包含純化步驟且內標、校準品、質控品均應全程參與提取純化，並提供詳細的驗證資料：應至少包括提取效率、重複性和抗干擾研究。

2.最低檢出限與定量限

2.1最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進行梯度稀釋並多次檢測，將具有95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。至少應不高於國家參考品最低檢出限50IU/ml的要求，根據循證醫學中有關對HCV感染者進行抗病毒治療效果及預後評估的需要，企業可根據自身產品性能情況和臨床診療指南設定檢測下限以符合臨床需求。定量限應高於或等於檢出限，將多次（至少20次）測量的結果符合試劑準確度要求的最低病毒水平作為定量限。

血清、血漿應分別進行最低檢測限的驗證。

2.2最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應在最低檢出限或接近最低檢出限的C型肝炎病毒濃度進行驗證，總測試數不少於60次。定量限的驗證應總測試數不少於40次。

企業應能夠提供用於最低檢出限/定量限驗證的病毒株的來源（1、2、3型）、型別確認及滴度確認試驗等信息。

3.線性範圍

線性範圍確定的研究可使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）或假病毒進行梯度稀釋，稀釋液應使用經確認為陰性的混合人血清或血漿，包含不少於9個濃度（應包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進行試驗。通過評價一定範圍內的線性關係及各水平的準確度確定該產品的線性範圍，評價的基因型別至少應包括1、2、3型。

4.準確度

對測量準確度的評價依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收實驗、方法學比對等方法，企業可根據實際情況選擇以下方法的一項或幾項進行研究。

4.1國家/國際參考品驗證

此類檢測試劑有相應的國家/國際參考品，應使用國家/國際參考品對試劑進行驗證，重點觀察對相應參考品檢測結果的符合情況。

4.2回收試驗。用於評估定量檢測方法準確測定加入國家/國際參考品的能力，結果用回收率表示。通常對樣本進行3～5次回收試驗，取平均值即平均回收率。

回收試驗注意事項：

4.2.1加入的標準液體積一般應小於樣本體積的10%；

4.2.2儘量使加入標準液後樣本中的被測物濃度接近醫學決定水平；

4.2.3標準物的濃度應該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本；

4.2.4注意基質效應，儘量採用與臨床待測樣本一致的基質。

4.3方法學比對

採用參考方法或國內/國際普遍認為質量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時檢測一批病人樣品，從測定結果間的相關性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關，說明兩檢測系統對病人標本測定結果基本相符，對同一份臨床樣本的醫學解釋，兩檢測系統不會產生顯著差異結果。
實施方法學比對前，應分別對擬申報試劑和對比試劑進行初步評估，只有在確認兩者都分別符合各自相關的質量標準後方可進行比對試驗。方法學比對時應注意質量控制、考慮樣本類型、濃度分布範圍等並對結果進行合理的統計學分析（如，報告斜率和截距的95%置信區間）。

5.精密度

測量精密度的評價方法並無統一的標準可依，可根據不同產品特徵或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性，具體實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批准指南（CLSI-EP）或國內有關體外診斷產品性能評估的檔案進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異係數的範圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要變數進行驗證，除申報試劑（包括提取組分和聚合酶鏈反應組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

5.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少於2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重複實驗以對室間精密度進行評價。

5.3用於精密度評價的質控品應至少包括兩個水平:

5.3.1弱陽性質控品：待測物濃度呈弱陽性（高於定量限濃度1個數量級），陽性檢出率為100%且變異係數（CV）符合標準要求（n≥20）。

5.3.2強陽性質控品：待測物濃度呈中度至強陽性，陽性檢出率為100%且CV符合標準要求（n≥20）。

6.HCV不同基因型的覆蓋：

應至少對最低檢測限和線性範圍的評估覆蓋全部申報基因型，至少包括1、2、3型。

7.特異性

7.1交叉反應

7.1.1用於HCVRNA檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床症狀（推薦種類見表1）。

7.1.2建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106cfu/ml或更高，病毒為105pfu/ml或更高。

7.1.3申請人應提供所有用於交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。

表1用於交叉反應研究的微生物（推薦）

微生物

黃病毒科（如：西尼羅病毒等）

登革熱病毒

人巨細胞病毒

E-B病毒

人類免疫缺陷病毒1、2

B型肝炎病毒

A型肝炎病毒

梅毒螺旋體

人類皰疹病毒6型

單純皰疹病毒1型

單純皰疹病毒2型

甲型流感病毒

金黃色葡萄球菌

白色念珠菌

7.2干擾物質

7.2.1潛在的干擾物質主要包括：內源性物質（見表2）和常用的治療藥物如普通干擾素IFN-α、複合IFN和聚乙二醇干擾素α、利巴韋林、粒細胞刺激因子（GMCSF）等，應採用已報導峰濃度的幾倍藥物濃度進行驗證。

7.2.2使用醫學相關水平的干擾物濃度進行驗證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(最差條件)條件下進行評價。對於常見藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進行干擾驗證。

7.2.3建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質的干擾影響進行檢測。

表2建議用於干擾研究的物質（推薦）

干擾物質

膽紅素*

游離血紅蛋白*

甘油三酯*

系統性紅斑狼瘡患者血

抗核抗體

類風濕因子

總G型免疫球蛋白（IgG）

*為必須驗證的干擾物質。

7.2.4使用HCVRNA陰性樣本（血清、血漿）進行評估，評估試劑的特異性。

8.其他需注意問題

對於適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用於不同樣本類型，應提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝劑的採血管的驗證。

（五）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對於實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期後的研究資料。

應對樣本穩定性進行研究，主要包括對不同樣本類型（血清、血漿）室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度範圍內選擇溫度點（溫度範圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。適於冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（六）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據。因此，產品說明書是體外診斷試劑註冊申報最重要的檔案之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口產品的中文說明書除格式要求外，其內容應儘量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的註冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規範格式對此內容進行標註，並單獨列明參考文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對HCVRNA測定試劑說明書的重點內容進行詳細說明。

1.【預期用途】應描述為：試劑用於定量檢測人血清/血漿樣本中的HCVRNA,用於需進行HCV感染診斷的患者和接受抗病毒治療的C型肝炎患者，應當說明該試劑能夠檢測的基因型別。檢測結果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析並明確說明該檢測試劑不得用於血源篩查。

應對C型肝炎病毒感染及治療臨床背景進行簡介。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒所包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，如定量標準品、陰/陽性質控品含有人源組分，應提供其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應列出相關試劑/耗材的名稱、註冊證號（如有）及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用於核酸分離/純化的試劑組分，則應在此註明經驗證後推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產企業、產品名稱、註冊證號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及效期。

應按照《醫療器械說明書和標籤管理規定》（總局令第5號）增加生產日期，使用期限或者失效日期。

4.【樣本要求】

4.1樣本收集要求：結合臨床需要並參照C型肝炎防治指南（現行版）推薦的採樣要求。

4.2血液樣本應當說明對採血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、採血管和抗凝劑，其他樣本應說明樣本採集、處理及保存方式。

4.3樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復至室溫，凍融次數的要求。如有需要應對高於檢測範圍的樣本稀釋方法進行規定。

5.【適用機型】註明所有適用的儀器型號，並提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

6.1試劑準備及配製方法、注意事項。

6.2詳述待測樣本、相關校準品及質控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

6.3核酸提取/純化方法的詳細介紹。

6.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

6.5PCR各階段的溫度、時間設定、循環設定及相關注意事項。

6.6儀器設定：特殊參數、結合探針的螢光素標記情況對待測基因及內標的螢光通道選擇。

6.7基線閾值、Ct值的選擇方法。

6.8校準方法的描述。

6.9實驗的有效性判斷：試劑盒內陰/陽性質控品、內標的Ct值要求。

7.【檢驗結果的解釋】

檢驗結果套用IU/ml表示，結合陰、陽性質控結果，對低於檢出限未檢出、低於定量限、檢測範圍內及高於檢測範圍的檢測結果分別進行界定。

8.【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其症狀/體徵、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

8.2可靠的結果取決於樣本採集、轉運、儲存及處理程式。

8.3明確該試劑僅限於規定的樣本類型及適用機型。

8.4被試驗處理劑和或探針覆蓋的病毒基因組高度保守片段內部發生的突變可能會導致檢測到的病毒含量偏低或者檢測不到病毒。

8.5HCVRNA的定量取決於樣本中存在的病毒顆粒數，而這會受到樣本收集方法，病人因素（如年齡，是否存在症狀）和/或感染階段等因素的影響。

9.【產品性能指標】詳述以下性能指標：

9.1評估方法、數據和結果。

9.2最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗證所採用的基因型。

9.3精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準、評價結果。

9.4線性範圍：確定線性範圍的方法、濃度範圍、相關係數等信息。

9.5對不同基因型的覆蓋：驗證該試劑對HCV不同基因型的檢測效果。

9.6特異性：

9.6.1交叉反應：易產生交叉反應的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經過交叉反應驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

9.6.2干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應註明可接受的最高限值。

9.6.3藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結果的影響，如未進行相關研究也應提供相關警示說明。

9.7臨床對比試驗研究：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所採用的統計學方法及統計分析結果。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

10.1由於本試驗涉及到病毒RNA的提取及PCR擴增，應小心避免試劑和擴增反應混合物受到污染。應推薦定期監測實驗室擴增產物存在的方法及步驟。

10.2應提示RNA提取擴增過程中的注意事項。

10.3有關人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內校準品、質控品或其他可能含有人源物質的組分，雖已通過B肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、C型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。提示對於潛在傳染源的處理方式。

10.4對於試劑中其他組分可能涉及到的潛在危險的提示，如防腐劑如有疊氮鈉等的風險警示及處理方式。

10.5臨床實驗室應嚴格按照《臨床基因擴增實驗室工作規範》配備設備及操作人員，應嚴格按照說明書要求進行操作。

（七）產品技術要求

擬定產品技術要求應符合《體外診斷試劑註冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）、《體外診斷試劑註冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產品作為第三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產工藝及半成品檢定等內容作為附錄附於技術要求正文後，應將待測靶基因區域，引物/探針來源、各種酶的來源、特性以及質量標準等信息的重點內容予以明確。

HCVRNA測定試劑的註冊檢測應符合相應國家參考品檢測要求，產品的性能指標應與說明書內容相符。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低於上述標準要求。可參考《YY/T1182-2010核酸擴增用檢測試劑(盒)》。

（八）註冊檢驗

根據《體外診斷試劑註冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）要求，首次申請註冊的第三類產品應在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢範圍的醫療器械檢驗機構進行連續三個生產批次樣品的註冊檢驗。如有適用的國家參考品，應採用國家參考品進行註冊檢驗並符合要求。

（九）臨床評價資料

1.研究方法

對於該類試劑已有同類產品上市，按照法規要求選擇境內已批准上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，採用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優於已上市產品。

建議預實驗選擇兩種對比試劑同時進行驗證，考察其誤差範圍，選擇其中一種作為正式試驗的對比試劑，另一種可作為第三方試劑（建議在此對第三方試劑的選擇原則作簡單介紹）。對比試劑的適用樣本類型及檢測範圍應能夠涵蓋考核試劑的樣本及檢測性能要求，以免造成考核試劑部分性能無法驗證的情況。

對比試驗結果不一致（檢測值差異較大）的樣本應採用公認較好的第三方試劑進行驗證。

強調：臨床試驗研究應使用說明書配套使用的提取純化試劑盒，並在方案中明示。

2.臨床試驗機構的選擇

建議申請人在選擇臨床試驗機構時，應考慮到各試驗機構之間的平行性和一定的地域代表性，臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程式等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應處於有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重複性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床試驗機構的方案設定應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內並由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案並明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應採用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應一致，以便進行合理的匯總統計學分析，同時方案中應明確寫明對測定結果不符的樣本進行確認的第三方試劑或方法。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗樣本數應不少於500例，其中應主要選擇C型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少於450例。在病例選擇時應考慮到地域性的差別，以1b及2a型為主，其他聲稱的可覆蓋基因型不少於10例，應注重不同藥物治療的C型肝炎患者。陽性樣本應覆蓋試劑線性範圍，均勻分布高、中、低值。建議選擇不少於50例的陰性樣本進行比對試驗，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應情況，應選擇其他類病毒性肝炎、其他病毒感染（如HIV）以及其他良性或惡性肝臟疾病患者（如，肝細胞癌、酒精肝、非酒精性脂肪肝、肝硬化、自身免疫性肝炎），以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應為實際臨床檢測中常用的樣本類型。對於增加與原樣本類型具有可比性的其他樣本類型，在滿足一種樣本類型不少於500例的前提下，可增加臨床試驗樣本數至少為200例，並在至少2家（含2家）臨床試驗機構開展的臨床試驗，其中陽性樣本應包括強、中、弱陽性，線上性範圍內均勻分布。

應對臨床樣本進行說明：新鮮或者為既往保存樣本，臨床研究應以新鮮樣本為主。稀有基因型可使用既往保存樣本。基因型確認可使用分型試劑或測序方法。

5.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，對於本類產品對比實驗的等效性研究，常用相關性、線性回歸對log10滴度結果進行統計分析，考察兩組數據之間是否存在相關性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標準。選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗，對檢驗結果進行符合率分析，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。

6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對於兩種試劑的檢測結果有不一致（檢測結果差異較大）的樣本，應採用“金標準”或其他合理的方法進行覆核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。如無需覆核，應詳細說明理由。

7.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，並應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

7.1臨床試驗總體設計及方案描述

7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

7.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

7.1.4統計學方法、統計軟體、評價統計結果的標準。

7.2具體的臨床試驗情況

7.2.1申報試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息，對比試劑廠商信息及產品醫療器械註冊證書號。

7.2.2對各研究單位的病例數、年齡分布情況、不同基因型分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

7.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本長期保存、結果不一致樣本的校驗等。

7.3統計學分析

7.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

7.3.2兩組數據結果的相關性、線性回歸的結果。

7.3.3對相關性及線性方程的顯著性檢驗，驗證兩種試劑定量結果的一致性。

7.3.4陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區間。

7.3.5以交叉表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗。

另外考慮到對不同樣本類型的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型分別進行統計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

7.4討論和結論

對總體結果進行總結性描述並簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最後得出臨床試驗結論。

名詞解釋

準確度（accuracy）：一個測量值與可接受的參考值間的一致程度。

精密度（precision）：在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異係數（CV）。

線性（linearity）：在給定測量範圍內，給出的測量結果與樣品中實際存在的被測量物的值成比例的能力。線性是描述一個測量系統的測量示值或測量結果相關於樣本的賦值符合直線的屬性。

分析特異性（analyticalspecificity）：測量程式只測量被測量物的能力。分析特異性用於描述檢測程式在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，並給出在特定醫學相關濃度值水平的分析干擾程度（潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物）。