Brd4通過一種新結合蛋白TDP-43調節HIV-1轉錄的機制研究

《Brd4通過一種新結合蛋白TDP-43調節HIV-1轉錄的機制研究》是依託廈門大學，由李晴擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：Brd4通過一種新結合蛋白TDP-43調節HIV-1轉錄的機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：李晴
• 依託單位：廈門大學

項目摘要

我們在前期工作中發現一個新的Brd4結合蛋白TDP-43，該蛋白可與HIV-1 TAR DNA結合抑制HIV-1轉錄。本項目擬研究Brd4通過與TDP-43結合調節HIV-1轉錄的新機制。首先通過蛋白印跡法、免疫螢光染色、免疫共沉澱、哺乳動物細胞蛋白-蛋白相互作用陷阱及雙分子螢光互補技術，從細胞外、細胞內乃至活細胞水平驗證Brd4與TDP-43之間的相互作用，明確TDP-43是一種新的Brd4結合蛋白；進一步通過螢光素酶實驗研究Brd4過表達或基因沉默對HIV-1轉錄的影響；再通過染色體免疫共沉澱，明確Brd4通過TDP-43對HIV-1轉錄進行調節；最後構建Brd4 N端截短變構體或結構域抑制劑使Brd4從染色體上解離，研究Brd4與染色體結合對HIV-1轉錄的作用，探討Brd4通過與TDP-43結合調節HIV-1轉錄的新機制。該研究將為進一步揭示HIV-1轉錄調控及潛伏機制提供新思路。

結題摘要

愛滋病是嚴重威脅人類健康的疾病，雖然近年來針對愛滋病的治療已經取得顯著性突破，尤其是通過抗逆轉錄病毒藥物的聯用，可有效清除患者體內HIV病毒的複製性感染；但HIV病毒感染CD4+T細胞後，有一部分病毒基因組會整合到宿主細胞的染色體上形成前病毒，以轉錄沉默的形式長期潛伏，一旦停止HAAT（highly active antiviral therapy，HAAT）治療，這些前病毒就會重新開始複製成為復發感染源。目前對於導致HIV病毒轉錄沉默及前病毒潛伏性整合的機制還不清楚，研究HIV病毒在體內的轉錄調控及潛伏機制對愛滋病的防治具有重大意義。愛滋病病原體人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的基因表達受到病毒因素和宿主因素的雙重調控。TDP-43是一種轉錄抑制因子，可通過與整合到細胞染色體上的HIV-1前病毒基因組TAR DNA結合，抑制HIV-1的轉錄。另一種宿主蛋白Brd4能通過與PTEF-b結合，競爭性抑制Tat蛋白與PTEF-b結合，從而抑制HIV-1的轉錄。我們在前期工作中發現TDP-43有可能是一種新的Brd4結合蛋白，因此本項目擬研究Brd4通過與TDP-43結合抑制HIV-1轉錄的新機制。我們首先通過蛋白印跡法、免疫螢光染色、免疫共沉澱、哺乳動物細胞蛋白-蛋白相互作用陷阱等實驗，從細胞外、細胞內乃至活細胞水平驗證Brd4與TDP-43之間的相互作用，明確了TDP-43是一種新的Brd4結合蛋白；進一步通過螢光素酶實驗證實Brd4可以負調控HIV-1的轉錄，當過表達Brd4時可顯著抑制HIV-1啟動子區的激活；而將Brd4敲除後可增強HIV-1啟動子區的活性；最後通過染色體免疫共沉澱，證明將Brd4過表達時可增強TDP-43與HIV-LTR TAR DNA區域的結合；而將Brd4敲除時TDP-43與HIV-LTR TAR DNA區域的結合會受到明顯抑制；並且，當用Brd4抑制劑JQ1處理細胞，使Brd4從染色體上解離時可顯著抑制TDP-43與HIV-LTR TAR DNA區域的結合，證明Brd4與染色體結合對抑制HIV-1轉錄的作用是必須的。通過以上研究，證明Brd4通過其N端兩個溴結構域與乙醯化染色體結合，並通過其C端與TDP-43結合併將TDP-43招募至HIV-1長末端重複序列的啟動子區，發揮抑制HIV-1的轉錄的作用。