ARC5與葉綠體分裂過程中外膜動態變化的分子機理

《ARC5與葉綠體分裂過程中外膜動態變化的分子機理》是依託北京林業大學，由高宏波擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：ARC5與葉綠體分裂過程中外膜動態變化的分子機理
• 依託單位：北京林業大學
• 項目負責人：高宏波
• 項目類別：面上項目

項目摘要

葉綠體是由內共生的藍細菌進化而來的細胞器，已知的葉綠體分裂基因大部分都是通過搜尋藍細菌細胞分裂基因在植物中的同源基因的方法被發現的。申請人首次通過作圖定位的方法克隆了一個葉綠體分裂基因-ARC5。ARC5是真核生物中的發動蛋白家族的一員。因此，葉綠體的分裂裝置也有源自於真核宿主的成分。初步研究顯示，ARC5可能在葉綠體分裂溝的收縮過程中對外膜進行重整。本項研究旨在對ARC5的功能進行較為深入的研究,具體包括：ARC5的特異性定位的分子機理；ARC5的GTPase活性以及ARC5對膜的重整的機理；ARC5與其它發動蛋白家族成員的差異；其它作用於葉綠體分裂溝部位外膜且有可能是源自真核宿主的葉綠體分裂蛋白的鑑定；ARC5與其它蛋白在葉綠體分裂溝的收縮過程中的協同作用。本項研究將使人們在分子水平上對葉綠體分裂過程中外膜動態變化的機理有一個深入的了解。

結題摘要

ARC5是一個起源於真核宿主細胞的葉綠體分裂蛋白，位於葉綠體分裂位點的外膜上。它可能通過水解GTP為葉綠體分裂提供動力。分析和研究ARC5以及與其相互作用的蛋白對深入研究葉綠體分裂的機制有重要的意義。 本課題通過使用EMS誘變野生型的擬南芥，篩選出一系列與arc5表型相似的葉綠體分裂突變體，並對兩個新發現的葉綠體分裂基因CPD25和CPD45做了深入的研究。另外，本課題對與ARC5相互作用的PDV1和PDV2進行了表達純化和初步的生物化學特性分析。這些研究拓展了人們對葉綠體分裂機制的認識，為今後進一步的研究提供了重要的基礎。經過遺傳分析，共鑑定出9個arc5等位突變體，1個pdv1突變體，4個pdv2等位突變體，4個cpd25等位突變體和5個cpd45等位突變體。這一系列突變體為研究ARC5以及與其相關的葉綠體分裂基因在葉綠體分裂過程中的作用提供了有用的實驗材料。CPD25和CPD45是兩個新發現的葉綠體分裂基因。令人意外的是，它們並不編碼葉綠體蛋白，它們均編碼轉錄因子。本課題進行了基因晶片分析、螢光定量RT-PCR、轉基因植物表型分析、凝膠阻滯實驗、酵母單雜交實驗、報告基因分析以及雙分子螢光互補等一系列試驗，分別在分子、細胞和遺傳等層面上對兩個基因的功能和作用機理進行了較為深入的研究。我們認為CPD25和CPD45以異源二聚體的形式結合到ARC5啟動子區特定的位點來激活ARC5基因的表達，進而影響葉綠體的分裂。這些工作是人們首次對葉綠體分裂基因表達調控的分子機制進行較為深入的研究。我們將PDV1的胞質側結構域在大腸桿菌中進行了表達，通過改變表達載體種類、基因片段大小、誘導劑濃度、誘導溫度以及構建分子伴侶與重組質粒的共表達系統來提高目的蛋白的可溶性表達量，最終獲得了大量的高純度蛋白。我們還將PDV2的胞質側結構域在大腸桿菌中進行了表達和純化，且又進一步通過Ni-NTA親和層析、離子交換層析以及分子篩層析進行了純化，並用圓二色譜法初步分析了其二級結構。這些試驗結果為研究這兩個蛋白的結構及其在葉綠體分裂過程中的作用奠定了一定基礎。