《AOG拮抗LPS調節TLR4的膜表達預防UC癌變的靶點研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由劉莉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：AOG拮抗LPS調節TLR4的膜表達預防UC癌變的靶點研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：劉莉
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
潰瘍性結腸炎（UC）癌變率高，缺乏預防措施。NF-κB參與UC癌變，由LPS通過TLR4活化NF-κB是UC癌變的重要通路；其中TLR4在細胞膜的表達是該通路被活化的關鍵。我們發現，5-半乳寡糖醛酸(AOG)具有顯著預防UC癌變作用，單獨使用可促進TLR4的細胞膜表達，與LPS聯合套用則抑制其引起的TLR4在細胞膜的表達，從而競爭性地抑制LPS引起的NF-κB活化，提示TLR4的膜表達是調控NF-κB活性，預防UC癌變的潛在靶點。本課題擬採用RNAi技術分別降低HT-29細胞TLR4及其輔助受體CD14、MD-2表達水平；套用FITC-AOG受體分析方法，觀察AOG影響TLR4膜表達的分子靶點；並對其靶分子進行定點突變，研究AOG與其靶分子的結合位點；闡明AOG預防UC癌變的分子機制。為AOG的構-效關係研究奠定基礎，為挖掘以TLR4為靶點的UC癌變化學預防藥物提供依據。
結題摘要
在以往的研究基礎上，本課題確認AOG對潰瘍性結腸炎（UC）癌變的抑制作用並研究其機制。進一步的研究表明：蘋果多糖可影響LPS/TLR4/NF-κB通路的很多環節，可降低LPS通過TLR4引起的MD2, MyD88, TRAM的水平升高，和IFN-β 和IL-6的水平降低。我們採用RNAi技術沉默TLR4，發現LPS和蘋果多糖均不能誘導NF-κB的活化，提示，蘋果多糖治療結腸炎癌變的作用確實通過拮抗LPS作用於TLR4引起的NF-κB活化而實現。蘋果多糖可誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴性，可通過升高Bax水平，降低Bcl-2和Bcl-xl水平而實現。對細胞周期的研究表明，蘋果多糖可促進細胞進入S期，降低Cdk 2和cyclin B1的表達，而不影響cyclin A1。為了確定AOG的作用靶點，我們克隆了TLR4、MD2和CD14 的cDNA ，構建了過表達質粒並在HEK293細胞中得到高效表達；同時設計了TLR4、MD2和CD14基因的shRNAs並構建了慢病毒介導的基因沉默系統。在HEK293過表達細胞中，針對三種基因的shRNAs的沉默效率均達到80%以上，顯示針對三種基因的沉默系統構建成功。根據基金的研究計畫，為了驗證AOG作用體系中重要的蛋白結合位點，課題組對TLR4、CD14所編碼的關鍵胺基酸進行了單點、雙點突變和三點突變，共獲得10個質粒。該類質粒經測序驗證後，轉染至HEK293細胞，經western blotting 驗證，CD14、TLR4、TLR4-M264、TLR4-M362、TLR4-M341M362、LY96、LY96 m58、LY96 m118、LY96 m122、LY96 m58+118均有顯著過表達效果，LY96 m58+122和LY96 m118+122未檢測到顯著過表達。雖然我們構建的過表達質粒和用於基因沉默質粒在HEK293能夠高效表達並達到理想效果，但是我們將構建質粒嘗試著轉染進入結腸癌細胞株(HT29，SW620,Sw48，GP2D) 時，發現其轉染效率均低於10%。因此，下一步研究中我們將著重提高轉染效率或者運用新的轉染方法，將獲得的質粒在結腸癌細胞株進行表達和沉默，繼續研究AOG的作用靶點。本項目共發表SCI文章6篇，獲得2項國家發明專利的授權,培養碩士生1名，博士生2名，博士後1名。
