《AKT調控DNA損傷檢驗點反應和同源重組修復機理的探討》是依託清華大學，由許乃寒擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：AKT調控DNA損傷檢驗點反應和同源重組修復機理的探討
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：許乃寒
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
DNA損傷檢驗點反應和損傷修復在維持細胞基因組穩定性和抑制細胞癌變中起著關鍵性的作用，其分子調控機制的闡明對於防癌抗癌有著重要的指導意義。近年的研究發現蛋白激酶AKT參與調控DNA損傷檢驗點反應和同源重組修復，然而其具體分子機理還很不清楚。我們在前期研究中發現蛋白激酶AKT在DNA損傷檢驗點反應和同源重組修覆信號途徑的多個信號分子上有潛在的磷酸化位點。高活性的AKT抑制這些信號分子在DNA損傷部位的募集並降低它們的穩定性，進而抑制損傷應答和修復。本項目將在上述基礎上，從細胞水平和整體水平上研究AKT對DNA損傷檢驗點反應和同源重組修覆信號通路的調控作用，探討其作用靶點及調控機制。此外，AKT在很多惡性腫瘤中表達異常，AKT信號通路已經成為新一代抗腫瘤藥物研究的重要靶點，本研究也為今後多靶點特異性治療AKT活性異常的惡性腫瘤提供理論依據和潛在的臨床意義。
結題摘要
本研究計畫擬以DNA損傷檢驗點反應和DNA修覆信號途徑為研究對象，探討蛋白激酶AKT在該信號途徑的作用靶點和調控機制。我們發現在PTEN敲除導致高AKT激酶活性的細胞中，DNA損傷誘導後細胞內ATR-Chk1信號通路的活性顯著，並且ATR蛋白不能募集到DNA 損傷部位。抗磷酸化AKT底物抗體免疫沉澱實驗結合質譜技術證實蛋白激酶ATR是AKT的磷酸化底物，其蛋白氨基端存在一個RRRLSSS的胺基酸序列為AKT的磷酸化位點。為了驗證AKT磷酸化對ATR蛋白生物學功能的影響，我們構建了ATR真核表達質粒並對AKT磷酸化位點進行了定點突變。但突變質粒的表達量非常低，western blot幾乎無法檢測到突變蛋白的存在，因此我們對研究計畫進行了必要的調整和變動。首先，我們研究了細胞周期蛋白激酶Chk1在細胞周期檢驗點的調控作用。Chk1蛋白本身也是一個AKT的靶蛋白，Chk1絲氨酸280位點 能夠被AKT蛋白磷酸化，這種磷酸化修飾起著一種負調控作用因為磷酸化蛋白主要定位在細胞質中因此削弱了Chk1激酶的活性。已經有大量的文獻證明Chk1在DNA損傷應答和損傷修覆信號通路的作用，我們主要探討了敲除Chk1基因對細胞有絲分裂進程和紡錘體檢驗點反應的影響。研究發現敲除Chk1基因抑制細胞有絲分裂進程和中期染色體重排，此外Chk1 還能通過調控Mad2和Cdc20蛋白的表達和亞細胞定位影響APC蛋白酶降解系統的活性，研究成果發表在Life Sciences雜誌上。其次，我們發現一種微小核酸能夠調節mTOR/AKT信號通路進而影響細胞周期的進程以及細胞自噬的活性。微小核酸MIR155抑制mTOR/AKT信號通路上三個信號分子包括RheB，Rictor和p70S6K的表達，這三種蛋白的下調導致mTOR及AKT蛋白激酶活性的降低，從而誘導細胞自噬活性，抑制細胞增殖和細胞周期從G1到G2期的轉換過程，研究成果發表在Autophagy雜誌上。
