《AKR2A參與分選及定位葉綠體外被膜蛋白的結構基礎》是李紅美為項目負責人，中國科學院植物研究所為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：AKR2A參與分選及定位葉綠體外被膜蛋白的結構基礎
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李紅美
- 依託單位：中國科學院植物研究所
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
葉綠體是負責光合作用的細胞器。雖然葉綠體中含有自己的基因組，但其大多數蛋白質是由核基因組編碼的。核基因編碼的蛋白經翻譯後修飾從細胞質轉運到葉綠體。核編碼蛋白正確定位到葉綠體各腔室之前，需要在細胞質內被正確分選並定位到葉綠體外被膜上。但到目前為止該方面的研究很少。最近研究發現AKR2A在參與分選及定位葉綠體外被膜蛋白方面起著重要的作用。AKR2A作為可溶性胞內分選因子，結合一類含有TMD及CPR錨定信號的外被膜蛋白OEP7及Toc33；此外，AKR2A具有分子伴侶作用，阻止外被膜蛋白聚集沉澱，增加其可溶性並促進其定位。本課題的目標是通過解析AKR2A及其與OEP7（Toc33）複合物的晶體結構，深入研究AKR2A參與分選及結合葉綠體外被膜蛋白的分子機制，這對於理解葉綠體蛋白的生物發生、光合細胞器的建成和功能的實現以及真核生物的起源和進化等都有十分重要的意義。
結題摘要
本項目主要研究內容: 1.擬南芥AKR2A蛋白不同截短體的體外表達純化，晶體培養、篩選與最佳化及晶體結構解析。2.AKR2A(41-342)與OEP7(1-35)的複合物蛋白的共表達與純化，晶體培養、篩選和最佳化。3. AKR2A在水稻與大豆中的同源蛋白與OEP7(1-35)的表達純化與晶體篩選。4. 通過擬南芥AKR2A不同突變體及其與OEP7複合物蛋白的結合情況分析兩者的結合方式與可能位點。 本項目的主要結果，關鍵數據及科學意義:首先，得到衍射解析度為2.0Å的 AKR2A(211-342)片狀晶體並成功解析了其晶體結構。結構顯示該區段含有四個ankyrin repeat序列，每個ankyrin repeat序列是一對反向的α螺旋，每對反向α螺旋間是一段loop，四個ankyrin repeat序列摺疊在一起形成類似“L”形狀的一個結構。AKR2A(211-342)三維結構的解析對於研究AKR2A介導底物蛋白定位於葉綠體是十分重要的。其次，為得到AKR2A的及其與OEP7複合物蛋白的精細三維結構，完成了AKR2A(41-342)與OEP7蛋白的共表達純化及晶體篩選與最佳化，培養得到的晶體通過解析同AKR2A（211-342）的結構，推測AKR2A(41-342)在晶體生長過程中發生了蛋白降解。第三，在AKR2A(41-342)的基礎上做了不同位點的突變並檢測其與OEP7(1-35)的結合能力以確定AKR2A與OEP7相互作用的位點及結合方式。利用Instability軟體預測發現AKR2A(41-342)的177-179(EEE)位點及277-278(EK)位點可能是對蛋白穩定性比較關鍵的位點，這五個位點突變後AKR2A(41-342)M1M2仍與OEP7(1-35)結合。說明這些位點對於AKR2A與OEP7的結合不是必需的；此外，結果表明AKR2A的41-80區段對於AKR2A與OEP7的結合是很關鍵的。如果該段序列缺失，AKR2A與底物結合能力明顯下降。通過突變這段區域的疏水胺基酸，檢測表達蛋白還能否與底物結合，以此找到與底物結合關鍵的胺基酸位點。檢測發現突變55位的I及56位點的L為S後，AKR2A不與OEP7相互作用，同時突變47位的F、49位的F與52位的M為S，AKR2A與OEP7的結合能力下降，所以推測這些胺基酸位點對於AKR2A與OEP結合是必需的。
