《A型肉毒毒素誘導大鼠頜下腺細胞自噬的作用及機制研究》是依託北京大學，由蔡志剛擔任負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：A型肉毒毒素誘導大鼠頜下腺細胞自噬的作用及機制研究
- 項目負責人：蔡志剛
- 依託單位：北京大學
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
自噬(autophagy)是細胞受到刺激後吞噬自身的細胞質或細胞器，最終將吞噬物在溶酶體內降解的過程。我們前期的工作發現A型肉毒毒素(botulinum toxin type A, BTXA)抑制頜下腺分泌伴隨細胞自噬的發生，然而有關BTXA與自噬的研究國內外尚無報導。本課題擬以BTXA誘導頜下腺自噬為重點，研究BTXA誘導大鼠頜下腺內自噬體的堆積以及自噬相關蛋白表達和分布的變化，在組織水平上明確BTXA可誘導自噬；在培養的大鼠頜下腺細胞上明確BTXA能否誘導自噬以及其量效關係和時效關係，在細胞水平上探討BTXA誘導自噬對頜下腺結構、功能和細胞凋亡的作用，明確BTXA誘導自噬的信號轉導通路；通過小分子RNA干擾技術和質粒轉染技術選擇性敲低或過表達自噬相關基因，在分子水平上明確BTXA誘導頜下腺自噬的作用和分子機制。該研究將為BTXA作用機制的研究提供新方向，進一步擴展BTXA的臨床套用範圍。
結題摘要
課題組前期的實驗證實A型肉毒毒素（Botulinum Toxin type A， BTXA）可以誘導大鼠及家兔頜下腺細胞萎縮、間質增生。國外有研究報導稱，大鼠頜下腺細胞損傷和修復中常伴有自噬的發生，但BTXA誘導的腺體萎縮和間質增生是否和自噬有關不得而知。在本研究中，我們採用Western blot和免疫螢光檢測大鼠頜下腺內自噬相關蛋白輕鏈3 (light chain 3, LC3)的表達和分布情況。採用MTS法檢測BTXA對大鼠頜下腺細胞系C6 (submandibular gland cells，SMG-C6)的毒性作用。採用Realtime PCR和Western blot法檢測SMG-C6細胞中LC3和SQSTM1/p62 (sequestosome 1, SQSTM1/p62)的mRNA和蛋白表達情況。採用雷射共聚焦，觀察自噬體標記蛋白GFP-LC3與溶酶體示蹤劑LysoTracker的共定位情況，評估SMG-C6細胞自噬流的暢通情況。Western blot和免疫螢光結果顯示，BTXA可以暫時性地誘導大鼠頜下腺細胞內自噬體數量的增加。當BTXA作用於大鼠頜下腺1周和2周時，腺泡內自噬體和自噬體標誌蛋白LC3-II明顯增多，4周時開始恢復，注射後12周和24周時接近正常對照組水平。 MTS結果顯示BTXA對SMG-C6細胞的毒性作用有明顯的劑量和時間依賴性。在24小時內BTXA對細胞的增殖有抑制作用，當孵育時間超過24小時，對細胞的毒性作用減弱，細胞逐漸恢復並出現生長增殖現象。 Realtime PCR結果顯示，BTXA有誘導p62和LC3基因高表達的趨勢，但未顯示出統計學差異。Western blot結果顯示BTXA可以明顯增加LC3-II蛋白的表達，而p62蛋白表達未見明顯差異。自噬體標記物GFP-LC3與溶酶體示蹤劑LysoTracker的共定位結果顯示，BTXA作用於SMG-C6細胞後，引起細胞內的自噬體數量增多，但自噬體和溶酶體的融合卻出現了失共定位現象，提示BTXA干擾了自噬體與溶酶體融合。本研究對完善BTXA抑制腺體分泌的作用機制有重要的實際意義，也為BTXA的臨床套用和基礎研究提供新的思路。
