《鼠疫菌T3SS結構蛋白YscI-YscF相互作用機制和功能研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由楊慧盈擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：鼠疫菌T3SS結構蛋白YscI-YscF相互作用機制和功能研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：楊慧盈
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
T3SS作為鼠疫菌的一種主要毒力決定因子，能夠在細菌表面形成一個注射小體，注射效應蛋白到宿主細胞中去，進而侵襲宿主的免疫回響系統。鑑定T3SS各組分間的蛋白相互作用，將有助於闡明耶爾森菌注射小體的結構和功能。本研究將通過採用酵母雙雜交陣列篩選技術，研究鼠疫菌T3SS內部蛋白間的相互作用。鼠疫菌pCD1質粒編碼基因中，除去質粒複製、分配相關基因，假基因，轉座酶基因等後，剩餘的57個基因全部包括在本研究內。挑選YscI與YscF相互作用進行作用機制和功能研究。分別通過體內、體外相互作用，以及該相互作用對鼠疫菌的III型分泌、注射小體組裝及毒力的影響，將通過基因突變、蛋白表達、GST pull down、免疫共沉澱及細胞和小鼠毒力實驗進一步描述。這些數據將有助於我們更深入的理解鼠疫菌的致病機制，為鼠疫菌的預防與控制做出貢獻。
結題摘要
T3SS作為鼠疫菌的一種主要毒力決定因子，能夠在細菌表面形成一個注射小體，注射效應蛋白到宿主細胞中去，進而侵襲宿主的免疫回響系統。鑑定T3SS各組分間的蛋白相互作用，將有助於闡明耶爾森菌注射小體的結構和功能。首先，通過酵母雙雜交陣列篩選技術篩選到 57 個蛋白之間的 21 個相互作用對，其中新發現12 對，包括 YscF-YscI。而後，採用GST-pull down方法確定了鼠疫菌蛋白 YscI 與 YscF體外存在相互作用。構建YscI系列截短體突變株，證實介導 YscI 與 YscF 相互作用的關鍵結構域位於83-92位胺基酸。進而構建 YscI 系列點突變體，證實 YscI 第 85 和 86 位胺基酸為影響相互作用的關鍵胺基酸位點。在此基礎上，運用免疫共沉澱的方法驗證了 YscI-YscF體記憶體在相互作用，且介導相互作用的關鍵結構域及關鍵胺基酸位點與體外實驗結果一致。最後，本研究確定了YscI 與YscF 相互作用在鼠疫菌T3SS 發揮生理功能中的作用。採用YscF 聚合體交聯法及WB實驗證實YscI 與YscF 相互作用在分子水平上影響YscF 針狀結構的組裝及 T3SS 效應蛋白的正常分泌。通過細菌感染 HeLa細胞後細胞形態的觀察以及 RTCA 實時定量分析實驗證實YscI 與YscF 相互作用在細胞水平上影響細胞毒力及轉運效應蛋白的能力。影響生理功能的關鍵結構域位於83-92位胺基酸，其中第 85 和 86 位胺基酸為關鍵胺基酸位點。本研究通過構建鼠疫菌構建鼠疫菌T3SS 模型，揭示一批的新的相互作用及一些可能存在的新成員，為深入認識鼠疫菌 T3SS 的結構和功能提供重要信息。本研究深入研究了 YscF 與 YscI 的相互作用，證實 YscF 與 YscI 體內、體外均存在相互作用，該相互作用影響鼠疫菌 T3SS 注射小體的組裝、效應蛋白的分泌、細菌毒力等生理功能。為鼠疫菌致病機制研究、預防和治療手段的研究奠定基礎。
