黃斑藍子魚對刺激隱核蟲的天然抗性機制研究

《黃斑藍子魚對刺激隱核蟲的天然抗性機制研究》是依託華南農業大學，由但學明擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：黃斑藍子魚對刺激隱核蟲的天然抗性機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：但學明
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

刺激隱核蟲已經成為我國海水養殖業危害最大的寄生蟲，它能夠感染幾乎所有的海水硬骨魚類，但黃斑藍子魚對其具有天然抗性，幾乎不被感染。我們發現黃斑藍子魚血清中含有對刺激隱核蟲具有強烈殺滅作用的抗蟲因子，但尚不清楚這些殺蟲因子的性質及作用機制。本研究將深入分析黃斑藍子魚血清和黏液中殺蟲因子的種類、性質、來源、組織分布、表達水平；分離鑑定對刺激隱核蟲具有天然殺滅作用的活性因子，分析其分子結構，建立其純化方法，克隆鑑定抗蟲基因，進行基因工程表達，測定重組蛋白的抗蟲活性；通過揭示活性因子殺蟲的作用靶點及作用途徑，闡明活性因子的殺蟲機理。通過上述研究，確定黃斑藍子魚抗刺激隱核蟲的物質基礎，闡明黃斑藍子魚對刺激隱核蟲的天然抗性機制。在此基礎上，進一步開展抗蟲活性因子的初步套用研究，以期為刺激隱核蟲的防治開闢新途徑。本項目的結果對研究魚類的先天性免疫和寄生蟲病防控都有重要的意義。

結題摘要

刺激隱核蟲已經成為我國海水養殖業危害最大的寄生蟲，它能夠感染幾乎所有的海水硬骨魚類，但黃斑藍子魚對其具有天然抗性，幾乎不被感染。我們發現黃斑藍子魚血清中含有對刺激隱核蟲具有強烈殺滅作用的抗蟲因子，但尚不清楚這些殺蟲因子的性質及作用機制。在本研究中，我們從其血清中分離到了一種抗微生物蛋白（APP），確定APP蛋白屬於L-胺基酸氧 化酶（LAAO）家族一員，進而獲得了該APP蛋白的的cDNA序列全長。然後實現了 SR-LAAO 在 大腸桿菌的重組表達，通過MTT分析、 光學顯微鏡觀察和掃描顯微鏡觀察結果表明，SR-LAAO重組蛋白對刺激隱核蟲幼蟲具有顯著的細胞毒性，重組蛋白整個殺蟲過程與黃斑藍子魚血清中分離到的天然SR-LAAO體外作用於刺激隱核蟲幼蟲的過程相似。此外，利用SR-LAAO重組蛋白純品作為抗原，免疫小鼠，製備了小鼠SR-LAAO重組蛋白的多克隆抗血清，該小鼠多克隆抗血清可用於SR-LAAO重組蛋白的識別和檢測。隨後我們實現了SR-LAAO在真核表達系統—畢赤酵母表達系統的重組表達，誘導表達產物對測試菌，均具有抑菌活性。掃描電鏡觀察結果發現，細菌表面變得粗糙，有明顯的顆粒狀附著物，細胞壁有內陷，細胞膜有發生破裂。在獲得大腸桿菌重組表達的 SR-LAAO 重組蛋白純品的基礎上，製備了SR-LAAO 重組蛋白的單克隆抗體。將3-HSR2 細胞株純化後的單克 隆抗體稀釋 1000倍，可作為特異抗體檢測大腸桿菌誘導表達的 SR-LAAO 重組蛋白，而將抗體稀釋 500倍後，可作為特異抗體對黃斑藍子魚血清 SR-LAAO 進行識別，該抗體可用於免疫親和層析柱的研製，以及 SR-LAAO 免疫機制的進一步研究。本研究闡明了SR-LAAO的性質、來源、組織分布、表達水平、殺蟲的作用位點和作用途徑等問題，從分子水平解析這種活性因子抗刺激隱核蟲的作用機理，研究成果具有重要的理論價值和深遠的現實意義，一方面，從分子水平闡明這種活性物質的抗蟲機制，揭示了黃斑籃子魚抗刺激隱核蟲感染的根本原因，為進一步研究魚類抵禦寄生蟲感染的先天性免疫機制提供了理論基礎。另一方面，抗蟲活性因子的初步套用研究為刺激隱核蟲的防治開闢了一條新途徑，在目前急需切實有效防控措施的情況下，無疑具有廣闊的套用前景。