《鯉春病毒血症病毒(SVCV)逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測方法(SN/T 1152-2002)》是在總結我國在這一領域的實踐經驗並參考國際上有關檢測規程的基礎上制定的。本標準的附錄A是資料性附錄。本標準由國家認證認可監督管理委員會提出並歸口。本標準起草單位：中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：江育林、高隆英、劉葒、史秀傑。
基本介紹
- 書名：鯉春病毒血症病毒
- 作者：中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局
- 出版日期：2003年3月1日
- 語種：簡體中文
- ISBN：155066215006
- 外文名：Test Method of Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)for Spring Viraemia of Carp Virus(SVCV)
- 出版社：中國標準出版社
- 頁數：5頁
- 開本：16
- 品牌：北京勁松建達科技圖書有限公司
內容簡介,文摘,
內容簡介
《鯉春病毒血症病毒(SVCV)逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測方法(SN/T 1152-2002)》由中國標準出版社出版。
文摘
著作權頁：
3.8無水乙醇
分析純，使用前預冷到－20℃。
3.9礦物油
要求無DNA酶和RNA酶。
4器材和設備
4.196孔細胞培養板
4.2倒置顯微鏡
4.3恆溫培養箱
4.4普通冰櫃和低溫冰櫃
4.5組織研磨器
4.6離心機和離心管
4.7 PCR擴增儀
4.8電泳儀
4.9微量移液器及吸頭
4.10紫外觀察燈
5 SVC病毒的分離
5.1 採樣
對有臨床症狀的魚，如是體長小於等於4 cm的魚苗取整條魚，體長4 cm～6 cm的魚苗取內臟（包括腎）；體長大於6 cm的魚則取腦、肝、腎、脾。而對無症狀的魚要取腎、脾、鰓和腦組織，成熟雌魚還需取卵巢液。按GB/T 18088－2000採樣。
5.2樣品處理
應在10℃以下。先用組織研磨器將樣品勻漿成糊狀，再按1：10的最終稀釋度重懸於培養液中。如果在勻漿前未用抗菌素處理過樣品，則須將樣品勻漿後再懸浮於含有1000 TU/mL青黴素和1000 μg/mL鏈黴素的培養液中，於15℃下孵育2 h～4 h或4℃下孵育6 h～24 h。7000 r/min離心15 min，收集上清液。卵巢液也要用上述濃度的抗菌素處理以防污染。不必勻漿但需稀釋2倍以上。用相同的方法離心卵巢液樣品並在以後的步驟中直接用其上清液。
5.3病毒分離
對1：10的組織勻漿上清液再作兩次10倍稀釋，然後將這1： 10，1：100和1：10003個稀釋度的上清液以適當體積分別接種到生長約24 h的EPC、CO或者FHM細胞單層中，每孔（2 cm2）的細胞單層最多接種100 μL稀釋液。15℃～20℃吸附0.5 h～1 h後，加入細胞培養液。置於18℃±2℃培養。試驗中要有2孔陽性對照（接種SVC標準株），和空白對照（未接種病毒的細胞）。
陽性對照和待測樣品都接種細胞後，7d內每天用40倍到100倍倒置顯微鏡檢查。空白對照細胞應當正常。如果接種了被檢勻漿上清稀釋液的細胞培養中出現細胞病變（CPE），應立即進行鑑定。如果除陽性對照細胞外，沒有CPE出現，則在培養7d後還要用敏感細胞進行再傳代培養。傳代時，將接種了組織勻漿上清稀釋液的細胞單層培養物凍融一次，以7000 r/min，4℃離心15 min，收集上清液。將上清液接種到新鮮細胞單層，培養7d。每天用40倍到100倍倒置顯微鏡檢查。
如果陽性對照也未出現CPE，則必須換用敏感細胞和一批新的組織樣品重新進行另一系列的病毒學檢查。
3.8無水乙醇
分析純，使用前預冷到－20℃。
3.9礦物油
要求無DNA酶和RNA酶。
4器材和設備
4.196孔細胞培養板
4.2倒置顯微鏡
4.3恆溫培養箱
4.4普通冰櫃和低溫冰櫃
4.5組織研磨器
4.6離心機和離心管
4.7 PCR擴增儀
4.8電泳儀
4.9微量移液器及吸頭
4.10紫外觀察燈
5 SVC病毒的分離
5.1 採樣
對有臨床症狀的魚，如是體長小於等於4 cm的魚苗取整條魚，體長4 cm～6 cm的魚苗取內臟（包括腎）；體長大於6 cm的魚則取腦、肝、腎、脾。而對無症狀的魚要取腎、脾、鰓和腦組織，成熟雌魚還需取卵巢液。按GB/T 18088－2000採樣。
5.2樣品處理
應在10℃以下。先用組織研磨器將樣品勻漿成糊狀，再按1：10的最終稀釋度重懸於培養液中。如果在勻漿前未用抗菌素處理過樣品，則須將樣品勻漿後再懸浮於含有1000 TU/mL青黴素和1000 μg/mL鏈黴素的培養液中，於15℃下孵育2 h～4 h或4℃下孵育6 h～24 h。7000 r/min離心15 min，收集上清液。卵巢液也要用上述濃度的抗菌素處理以防污染。不必勻漿但需稀釋2倍以上。用相同的方法離心卵巢液樣品並在以後的步驟中直接用其上清液。
5.3病毒分離
對1：10的組織勻漿上清液再作兩次10倍稀釋，然後將這1： 10，1：100和1：10003個稀釋度的上清液以適當體積分別接種到生長約24 h的EPC、CO或者FHM細胞單層中，每孔（2 cm2）的細胞單層最多接種100 μL稀釋液。15℃～20℃吸附0.5 h～1 h後，加入細胞培養液。置於18℃±2℃培養。試驗中要有2孔陽性對照（接種SVC標準株），和空白對照（未接種病毒的細胞）。
陽性對照和待測樣品都接種細胞後，7d內每天用40倍到100倍倒置顯微鏡檢查。空白對照細胞應當正常。如果接種了被檢勻漿上清稀釋液的細胞培養中出現細胞病變（CPE），應立即進行鑑定。如果除陽性對照細胞外，沒有CPE出現，則在培養7d後還要用敏感細胞進行再傳代培養。傳代時，將接種了組織勻漿上清稀釋液的細胞單層培養物凍融一次，以7000 r/min，4℃離心15 min，收集上清液。將上清液接種到新鮮細胞單層，培養7d。每天用40倍到100倍倒置顯微鏡檢查。
如果陽性對照也未出現CPE，則必須換用敏感細胞和一批新的組織樣品重新進行另一系列的病毒學檢查。
