高效抗Cyclin D1胞內抗體抑制腫瘤細胞增殖的分子作用機制

《高效抗Cyclin D1胞內抗體抑制腫瘤細胞增殖的分子作用機制》是依託吉林大學，由李桂英擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：高效抗Cyclin D1胞內抗體抑制腫瘤細胞增殖的分子作用機制
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李桂英
• 依託單位：吉林大學

項目摘要

Cyclin D1是細胞進入增殖周期合成的第一個周期蛋白，是腫瘤防治的一個重要靶點。申請人研究組曾首次以Cyclin D1為靶點研製了具有抗腫瘤效應的腫瘤靶向高效抗CyclinD1人源胞內單鏈抗體，該抗體具有較好的潛在臨床套用前景。但目前該抗體是如何與抗原相互作用，進而如何影響Cyclin D1的信號傳遞，抑制腫瘤細胞增殖的分子作用機制尚不清楚。鑒於此，本課題擬利用抗原表位篩選結合計算機模擬來分析抗原抗體的相互作用以及抗體對抗原構象、生物學活性影響的分子基礎，同時利用差異蛋白質組學方法分析胞內抗體對Cyclin D1介導的相關信號分子的表達和活化的影響，建立抗Cyclin D1胞內抗體抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的分子調控網路，最後，明確和闡釋該抗體的分子作用機制，為這一新型胞內抗體進入臨床奠定基礎,為該抗體腫瘤臨床靶向治療策略提供參考依據，同時也為胞內抗體作用機制研究建立技術平台。

結題摘要

Cyclin D1是細胞進入增殖周期合成的第一個周期蛋白，是腫瘤防治的一個重要靶點。負責人研究組曾首次以Cyclin D1為靶點研製了具有抗腫瘤效應的腫瘤靶向高效抗CyclinD1人源胞內單鏈抗體（AD），然而該抗體的抗腫瘤分子機制尚不清楚。鑒於此，本項目利用抗原表位篩選結合計算機模擬來分析抗原抗體的相互作用的分子基礎，同時利用差異蛋白質組學方法分析胞內抗體對Cyclin D1介導的相關信號分子的表達和活化的影響，建立抗Cyclin D1胞內抗體抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的分子調控網路，進而明確和闡釋該抗體的分子作用機制。 通過噬菌體肽庫篩選、計算機模擬結合突變分析確定了該抗體與抗原作用的表位主要集中在Cyclin D1的 N末端1-120位胺基酸之間，抗體與抗原相互作用的關鍵胺基酸為N24, K33, K112, M113, K114, E115。定點突變分析發現112位的Lys對於該抗原抗體的相互作用至關重要。利用雙向電泳對帶有AD或空質粒的MCF-7細胞系進行差異蛋白組分析，發現43個差異蛋白點，質譜鑑定了其中24個蛋白點。這些蛋白參與了代謝、轉錄與翻譯、蛋白質運輸等通路。蛋白質組學結合驗證分析表明，AD的表達顯著抑制促腫瘤因子CBX3，NUDT5和PRDX4等分子的表達，但誘導CRMP2，FUBP2，PCBP1及促凋亡因子GRP78等分子的表達。免疫共沉澱實驗、Western blot結果表明，AD能抑制Cyclin D1與CDK4的結合，降低pRB蛋白的磷酸化水平；qPCR結果顯示，AD的表達下調CDK1，CDK4，Bcl-2等基因的表達，而上調p21，p27，p53等抑癌基因的表達。同時開展的腫瘤靶向抗CyclinD1胞內抗體對肝癌細胞增殖特性影響的研究，顯示出該胞內抗體較好的體內外抑瘤效應。最後，通過抗原抗體相互作用分析及蛋白質組學研究等結果，初步提出AD抑制腫瘤細胞增殖的分子機制：AD可能部分通過結合於Cyclin D1的N末端抑制CDK4的結合，抑制pRB的招募和磷酸化，從而影響下游一系列細胞增殖調控基因的表達，抑制腫瘤細胞的生長和增殖。 本項研究進一步表明抗Cyclin D1胞內抗體具有較好抑瘤效應，而且初步明確了該抗體的分子作用機制，為這一新型胞內抗體進入臨床奠定基礎,也為胞內抗體作用機制研究建立了技術平台。