《馬鞭草提取物及其製法和用途》是南京醫科大學於2003年5月14日申請的專利，該專利的申請號為031134742，公布號為CN1451661，公布日為2003年10月29日，發明人是徐昌芬、曾群、徐珊、羅莉。
《馬鞭草提取物及其製法和用途》是由中藥材馬鞭草全草用乙醇提取，濃縮乙醇提取液，加水，以石油醚提取，棄去石油醚提取液，水層用氯仿提取，蒸餾氯仿提取液所得的浸膏，即為給發明的馬鞭草提取物。該發明公開了其製備方法。該發明的馬鞭草提取物可以套用於製備抗早孕的藥物及製備抗滋養層細胞腫瘤的藥物。
2005年，《馬鞭草提取物及其製法和用途》獲得第四屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：馬鞭草提取物及其製法和用途
- 公布號：CN1451661
- 公布日：2003年10月29日
- 申請號：031134742
- 申請日：2003年5月14日
- 申請人：南京醫科大學
- 地址：江蘇省南京市漢中路140號
- 發明人：徐昌芬、曾群、徐珊、羅莉
- 分類號：C07H17/04、C07H1/08、A61K31/7048、A61K35/78、A61P15/04、A61P35/00
- 代理機構：南京知識律師事務所
- 類別：發明專利
- 代理人：黃嘉棟
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
馬鞭草系馬鞭草科（Verbenaceae）馬鞭草屬植物，學名Verbenaofficinalis，為一味傳統中藥。據《本草綱目》記載，其苗和葉可用於清熱解毒、利尿消腫，中國藥典則將其作為清熱、涼血、破血和消腫記載。
計畫生育是中國的國策。由於2003年5月前尚無一種完善的避孕措施，故人工流產為避孕失敗的一種必不可少的補救措施。據統計，中國每年約有1400萬人次行人工流產術，人流雖然較安全、簡便，但還有一定的併發症，對生殖道造成不同程度的機械損傷。抗早孕的化學藥物有兩種，一種為前列腺素（PG），另一種為米非司酮（RU486），兩者合併套用有效率達88.8％。但由於該藥價格較貴，合成工藝複雜；加之有較多的副反應，有時會引起不全流產乃至大出血。中草藥是中國中醫藥學中的一大寶庫，具有價格低、藥源豐富之特點。自七十年代初開始對天花粉、旋復花等進行臨床試驗，並不斷提純。1987年以來套用結晶天花粉蛋白注射液抗早孕取得較好的效果，但孕婦需住院宮腔內給藥，55.4％的病例有全身各種藥物反應，病人較難接受，故而尋找一種理想的能替代人流術的藥物是計畫生育工作者的一項重要任務。中草藥具有藥源豐富、價格低的特點，雖然近年來有些臨床套用的報導，但缺乏深入的研究。
滋養細胞腫瘤（包括絨毛膜癌和侵蝕性葡萄胎）是婦科較為常見的疾病，絕大多數患者為生育年齡的婦女。其病理學特點是增生的滋養細胞大片侵蝕子宮肌層及血管，早期發生全身轉移，特別是肺轉移及顱內轉移，對婦女的健康及生命危害極大。50-60年代，此病的死亡率很高，文獻統計絨毛膜癌的死亡率為90％以上，侵蝕性葡萄胎的死亡率在25％以上，並且大多患者因行子宮切除而喪失生育能力。自有效的化療藥物問世以後，使此病的死亡率顯著下降。單純化療對於有生育要求患者而言是有利的，但近年來隨著難治性、多藥耐藥性滋養細胞腫瘤的增多，常導致治療失敗。加之早期即可血行轉移，局部手術達不到根治的目的。2003年5月前臨床對惡性滋養細胞腫瘤的治療仍以化療為主，如5-Fu、5-MP、MTX等，化療藥物副作用大，耐藥患者需多種藥物同時反覆注射，對造血、心、肝、腎功能造成嚴重的損傷。在中國醫院收治的水泡狀胎塊（葡萄胎）患病率占妊娠總人數的0.6％，再次患病率增至3.74％，近年文獻報導葡萄胎的惡變率為10％-20％之間。故而尋找一種抗滋養細胞腫瘤，抗耐藥或延遲耐藥的出現，預防良性葡萄胎惡變的有效藥物是廣大醫藥科技人員研究的熱點。
2003年5月前，中國國內外對滋養細胞腫瘤的治療仍為化療、手術、放療及免疫療法，其中以化療和手術療法為主。大多研究內容為聯合化療藥物的配伍，治療劑量及用藥時間的間隔。發掘祖國傳統中藥，尋找一種抗滋養層細胞腫瘤的有效藥物研究近10年文獻檢索中未見報導。
發明內容
專利目的
《馬鞭草提取物及其製法和用途》的目的是提供一種馬鞭草的提取物及其製備方法。馬鞭草提取物對小鼠急性經口毒性試驗結果表明，其最大耐受量為＞16000毫克/千克，因此《馬鞭草提取物及其製法和用途》的再一個目的是提供其在製備抗早孕藥物、抗滋養細胞腫瘤藥物中的套用。
技術方案
一種馬鞭草提取物，它是由中藥材馬鞭草全草用乙醇提取，濃縮乙醇提取液，加水，以石油醚提取，棄去石油醚提取液，水層用氯仿提取，蒸餾氯仿提取液得浸膏，即為《馬鞭草提取物及其製法和用途》的馬鞭草提取物。
一種製備上述的馬鞭草提取物的方法，它由下列步驟組成：
步驟一、將馬鞭草全草W千克，用3W～8W千克95％乙醇加熱至沸，回流提取3小時，冷卻，過濾，濾渣再用3W～8W千克95％乙醇加熱至沸，回流提取3小時，冷卻，過濾除去沉澱，合併乙醇提取液，減壓蒸餾回收乙醇（壓力範圍為0.08～0.09兆帕，溫度範圍為60℃～70℃），至無醇味，加水至0.15～0.25W升，使每毫升相當3.3～6.5生藥，
步驟二、將步驟一製得的乙醇提取物水溶液每次加0.1～0.3W升石油醚萃取3～4次，棄去石油醚萃取液，保留水溶液，
步驟三、將步驟二所得的水溶液每次用0.1～0.3W升氯仿提取3～4次，合併氯仿提取液，減壓蒸餾（壓力範圍為0.08～0.09兆帕，溫度範圍為55℃～65℃）回收氯仿至無氯仿蒸出，得浸膏，即為《馬鞭草提取物及其製法和用途》的馬鞭草提取物。
上述的製備方法中，所述的石油醚是60～90℃的石油醚。
該發明的馬鞭草提取物可以套用於製備抗早孕的藥物。
該發明的馬鞭草提取物可以套用於製備抗滋養層細胞腫瘤的藥物。
該發明人以下列方法觀察該發明的馬鞭草提取物的藥用價值：以體外培養人早孕絨毛分離純化的滋養層細胞及人絨毛膜癌JAR細胞為實驗手段，套用細胞增殖抑制試驗（MTT比色法）、H-TdR及螢光顯色法來觀察該發明的馬鞭草提取物對細胞的抑制作用；將該發明的馬鞭草提取物給早孕小鼠灌服，觀察其對孕鼠子宮、胎盤及胎鼠的影響；建立裸鼠人絨毛膜癌實體瘤的動物模型，觀察該發明的馬鞭草提取物的抗腫瘤的體內效果。
改善效果
通過以上實驗方法表明：《馬鞭草提取物及其製法和用途》的馬鞭草提取物，對人早孕絨毛分離純化的滋養層細胞有明顯的抑制細胞增殖作用，HCG的分泌與對照組相比明顯減少，並呈時間及劑量依賴；能使孕鼠胎盤滋養層細胞及蛻膜細胞染色質邊聚，核空泡化，細胞固縮等退行性改變，明顯抑制胚胎生長；對人絨毛膜癌JAR細胞有抑制增殖、促細胞凋亡的作用；裸鼠人絨毛膜癌實體瘤的動物模型，觀察到了有抑制瘤體的發生、發展及延長荷瘤模型的生存時間，具有較為理想的體內作用。
附圖說明
圖1為培養對照組絨毛組織HCG免疫組化（合體滋養細胞內有反應強棕黃色陽性顆粒）×400的顯微照片；
圖2為加馬鞭草提取物培養48小時後絨毛組織HCG免疫組化（陽性部位反應明顯減弱）×400的光鏡照片；
圖3為培養對照組絨毛組織SDH酶組化（合體滋養細胞表面見蘭色陽性顆粒）×400的光鏡照片；
圖4為加馬鞭草提取物培養48小時後絨毛組織SDH酶組化（陽性部位反應減弱）×400的光鏡照片；
圖5為培養48小時後人肝癌SMMC-7721細胞株×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖6為加馬鞭草提取物後48小時人肝癌SMMC-7721細胞株×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖7為培養48小時後人胚肺二倍體成纖維細胞株（2BS）×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖8為加馬鞭草提取物後48小時2BS×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖9為馬鞭草提取物組的孕鼠子宮與對照組相比明顯改變；
圖10為馬鞭草提取物組與對照組胎鼠的比較，其中a為米非司酮組，b為馬鞭草提取物組，c為對照組；
圖11為加馬鞭草提取物後24小時，JAR細胞（可見中央部分細胞死亡）×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖12為加馬鞭草提取物後48小時，JAR細胞（可見大片細胞死亡）×400的比相倒置顯微鏡照片；
圖13為H-TdR摻入法顯示加馬鞭草提取物後對JAR細胞的抑制作用，其中，1為對照組；2為低劑量加藥組；3為中劑量加藥組；4為高劑量加藥組；
圖14為對照組JAR細胞EGFR表達免疫組化染色（胞質、核膜見棕色反應物）×400的光鏡照片；
圖15為20毫克/毫升馬鞭草提取物作用48小時JAR細胞EGFR表達免疫組化染色（陽性反應物減少）×400的光鏡照片；
圖16為對照組JAR細胞螢光染色（蘭色為活細胞，紅色為死細胞）×200的螢光顯微鏡照片；
圖17為加馬鞭草提取物後24小時JAR細胞螢光染色（死細胞數量增多）×200的螢光顯微鏡照片；
圖18為加馬鞭草提取物後48小時JAR細胞螢光染色（死細胞數量更多）×200的螢光顯微鏡照片；
圖19為加馬鞭草提取物後72小時JAR細胞螢光染色（細胞大多死亡）×200的螢光顯微鏡照片；
圖20為JAR細胞螢光染色的螢光顯微鏡照片，其中a為活細胞×200，b1為早期凋亡細胞×200，b2為早期凋亡細胞×400，c為晚期凋亡細胞×400，d為凋亡細胞核呈碎片狀；
圖21為早期凋亡細胞電鏡像×14000，染色質邊聚，核呈空泡狀，線粒體髓樣改變；
圖22為凋亡細胞電鏡像×6000，見凋亡小體（↑）；
圖23為培養48小時後對照組JAR細胞流式分析圖；
圖24為加馬鞭草提取物後48小時JAR細胞流式分析圖，見明顯的凋亡峰；
圖25為裸鼠人絨毛膜癌實體瘤模型，下圖為放大圖，△為實體瘤。
權利要求
1.一種馬鞭草提取物，其特徵是它是由中藥材馬鞭草全草用乙醇提取，濃縮乙醇提取液，加水，以石油醚提取，棄去石油醚提取液，水層用氯仿提取，蒸餾氯仿提取液所得的浸膏，即為該發明的馬鞭草提取物。
2.一種製備權利要求1所述的馬鞭草提取物的方法，其特徵是它由下列步驟組成：
步驟一、將馬鞭草全草W千克，用3W～8W千克95％乙醇加熱至沸，回流提取3小時，冷卻，過濾，濾渣再用3W～8W千克95％乙醇加熱至沸，回流提取3小時，冷卻，過濾除去沉澱，合併乙醇提取液，在壓力為0.08～0.09兆帕，溫度為60℃～70℃減壓蒸餾回收乙醇，至無醇味，加水至0.15～0.25W升，使每毫升相當3.3～6.5生藥，
步驟二、將步驟一製得的乙醇提取物水溶液每次加0.1～0.3W升石油醚萃取3～4次，棄去石油醚萃取液，保留水溶液，
步驟三、將步驟二所得的水溶液每次用0.1～0.3W升氯仿提取3～4次，合併氯仿提取液，在壓力為0.08～0.09兆帕，溫度為55℃～65℃減壓蒸餾，回收氯仿至無氯仿蒸出，得浸膏，即為該發明的馬鞭草提取物。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是所述的石油醚是60～90℃的石油醚。
4.根據權利要求1所述的馬鞭草提取物在製備抗早孕的藥物中的套用。
5.根據權利要求1所述的馬鞭草提取物在製備抗滋養層細胞腫瘤的藥物中的套用。
實施方式
實施例1
馬鞭草提取物的製備
步驟一、馬鞭草全草10千克，用80千克的95％乙醇加熱提取兩次，每次3小時，冷卻過夜，濾去沉澱，減壓蒸餾回收乙醇（0.08兆帕，60℃），至無醇味，加水定容至2000毫升（相當5克生藥/毫升），
步驟二、將步驟一得到的水溶液用石油醚（60～90℃）萃取4次，每次用1000毫升，保留水層，
步驟三、將步驟二保留的水層加入氯仿提取4次，每次用1000毫升，減壓蒸餾（0.08兆帕，55℃），回收氯仿至無溶劑蒸出，得浸膏，即為該發明的馬鞭草提取物，此馬鞭草提取物每毫升相當馬鞭草生藥100克。
實施例2
馬鞭草提取物的製備
步驟一、馬鞭草全草10千克，用30千克的95％的乙醇加熱提取兩次，每次3小時，冷卻過夜，濾去沉澱，減壓蒸餾回收乙醇（0.09兆帕，70℃），至無醇味，加水定容至1500毫升（相當6.5克生藥/毫升），
步驟二、將步驟一得到的水溶液用石油醚（60～90℃）萃取3次，每次用1500毫升，保留水層，
步驟三、將步驟二保留的水層加入氯仿提取4次，每次用1500毫升，減壓蒸餾（0.09兆帕，65℃），回收氯仿至無溶劑蒸出，得浸膏，即為該發明的馬鞭草提取物，此馬鞭草提取物每毫升相當馬鞭草生藥100克。
實施例3
馬鞭草提取物的製備
步驟一、馬鞭草全草10千克，用50千克的95％的乙醇加熱提取兩次，每次3小時，冷卻過夜，濾去沉澱，減壓蒸餾（0.09兆帕，70℃），回收乙醇，至無醇味，加水定容至3000毫升（相當3.3克生藥/毫升），
步驟二、將步驟一得到的水溶液用石油醚（60～90℃）萃取3次，每次用3000毫升，保留水層，
步驟三、將步驟二保留的水層加入氯仿提取4次，每次用3000毫升，減壓蒸餾（0.09兆帕，65℃），回收氯仿至無溶劑蒸出，得浸膏，即為該發明的馬鞭草提取物，此馬鞭草提取物每毫升相當馬鞭草生藥100克。
實施例4
馬鞭草提取物的抗早孕藥效研究
a）體外實驗
以人早孕絨毛分離純化的滋養層細胞作為實驗手段，於體外培養72小時後加入不同濃度的馬鞭草提取物，結果表明相當20毫克/毫升馬鞭草生藥的馬鞭草提取物能明顯抑制細胞增殖，HCG的分泌與對照組相比明顯減少，並呈時間及劑量依賴（見表1）。
b）體內實驗
將馬鞭草提取物於早孕小鼠灌服，觀察其對孕鼠子宮、胎盤及胎鼠的影響。
結果表明：一定劑量的馬鞭草提取物，能使孕鼠胎盤滋養層細胞及蛻膜細胞染色質邊聚，核空泡化，細胞固縮等退行性改變，明顯抑制胚胎生長，胚重0.100±0.08克、胚長0.23±0.12厘米，與生理鹽水對照組胚重0.23±0.17克、胚長0.84±0.24厘米，相比有顯著差異（見圖9、10，表2）。套用NYD-1000顯微圖象分析系統對胎盤微血管分布的絕對面積與相對面積進行定量分析，結果發現明顯小於對照組。動物實驗結果提示：一定濃度的馬鞭草提取物能致滋養細胞及蛻膜退行性改變，使胎盤組織萎縮，血流量減少，從而影響胚胎正常的生長發育。體內實驗結果與體外滋養層細胞培養結果互為佐證，進一步說明抗早孕的作用機制。
實施例5
馬鞭草提取物對早孕絨毛滋養層細胞形態及功能的影響
套用該室建立的滋養層細胞形態學研究的方法，於加藥後對細胞進行光鏡、電鏡觀察結構的變化；SDH酶組織化學、HCG免疫組織化學定量分析、表皮生長因子受體表達等細胞生物學及分子生物學方法，研究其影響。
a）對滋養層細胞增殖分化的影響
分離純化的滋養層細胞於培養24小時後，細胞逐漸向外生長，48小時生長旺盛，密度增加，細胞分裂相多，並見多數細胞聚集，有的相互融合形成多核的合體細胞。換培養液後，對照組繼續增殖，72小時細胞交織在一起形成大面積單層細胞。實驗組換液加馬鞭草提取物後繼續培養，相當20毫克/毫升馬鞭草生藥的馬鞭草提取物能明顯抑制其生長，48小時細胞增殖抑制率為58.7±2.0，與對照組相比P＜0.01，72小時抑制更為明顯，抑制率為78.3±3.1，P＜0.001（見表1）。
b）對滋養層細胞超微結構的影響
對照組細胞膜完整，微絨毛髮達，細胞內線粒體豐富，滑面內質網發達，核染色質疏鬆。加馬鞭草提取物後48小時可見細胞微絨毛明顯變短、減少，溶酶體及線粒體減少，滑面內質網擴張。髓樣小體增多，染色質邊聚，核中央電子密度變低。
c）對滋養層細胞分泌HCG的影響
套用該室建立的HCG單克隆酶免定量法，連續測定培養液中HCG的含量，對加馬鞭草提取物後的滋養層細胞分泌HCG作動態變化觀察。對照組48小時換液後HCG分泌量逐漸增多，48小時達換液前水平，72小時超過基數的22.6％。20毫克/毫升加馬鞭草提取物組加藥後48小時，培養液中HCG量為相應時間對照組的33.6％（P＜0.05），72小時為14.7％（P＜0.01）。隨著加藥的濃度增加，HCG分泌量減少，存在劑量依賴關係（見表3）。
d）對滋養層細胞琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性及絨毛膜促性腺激素（HCG）合成的影響
SDH酶組織化學及HCG免疫組織化學反應，套用NYD-1000顯微立體圖象分析系統對SDH、HCG進行定量分析，相當20毫克/毫升生藥加馬鞭草提取物組SDH活性抑制率為73.4％，HCG合成抑制率為67.8％，並隨著加藥劑量增加而抑制越趨明顯（見圖1-4，表4）。
實施例6
馬鞭草提取物的細胞毒性實驗
為了進一步確定該有效部位對滋養層細胞抑制作用是否系一般細胞毒性作用還是特異性作用，該實驗以同劑量的藥液作用於體外培養的人胚肺二倍體成纖維細胞株、人肝癌SMMC-7721細胞株及人絨毛膜癌JAR細胞株。結果顯示，《馬鞭草提取物及其製法和用途》的馬鞭草提取物對人胚肺二倍體成纖維細胞株及人肝癌SMMC-7721細胞株的生長無明顯抑制作用，對人絨毛膜癌JAR細胞有顯著的抑制作用，並呈劑量及時間依賴（見圖5～8）。以上結果說明該部位對滋養層細胞的作用具有特異性，包括正常及病理滋養層細胞。
實施例7
馬鞭草提取物對人絨毛膜癌JAR細胞抑制作用的機制研究
觀察一定濃度馬鞭草提取物對人絨毛膜癌JAR細胞抑制作用，並研究其作用的分子生物學機制。
實驗結果顯示：一定濃度的馬鞭草提取物致JAR細胞表皮生長因子受體（EGFR）表達減少（見圖14、15），細胞增殖抑制（見圖11、12），具有促細胞凋亡作用。
H-TdR法顯示加藥後48小時細胞增殖僅為相應對照組的30.05％（見圖13）；套用免疫組織化學ABC法顯示EGFR的表達為對照組的27.04％；AO/EB螢光染料複合染色、螢光顯微鏡下可見凋亡細胞（見圖16～20）；透射電鏡下有明顯的凋亡小體（見圖21、22）；流式細胞術出現凋亡峰（見圖23、24）。
在此基礎上，我們已建立了裸鼠JAR細胞實體瘤的動物模型（見圖25）。初步觀察到了馬鞭草提取物有抑制瘤體的發生、發展及延長荷瘤模型的生存時間，具有較為理想的體內作用。
表1a：加藥後24小時馬鞭草提取物對滋養層細胞增殖抑制率（X±S） | |||
/ | 藥物濃度（毫克/毫升） | ||
10 | 20 | 40 | |
馬鞭草提取物 | 13.7±1.0 | 23.4±2.6 | 38.6±3.1 |
對照組 | - | 1.7±0.5 | - |
表1b：加藥後48小時馬鞭草提取物對滋養層細胞增殖抑制率（X±S） | |||
/ | 藥物濃度（毫克/毫升） | ||
10 | 20 | 40 | |
馬鞭草提取物 | 15.2±3.3 | 58.7±2.0 | 83.8±5.4 |
對照組 | - | 4.3±1.2 | - |
表1c：加藥後72小時馬鞭草提取物對滋養層細胞增殖抑制率（X±S） | |||
/ | 藥物濃度（毫克/毫升） | ||
10 | 20 | 40 | |
馬鞭草提取物 | 25.8±1.7 | 78.3±3.9 | 93.3±2.7 |
對照組 | - | 3.7±0.8 | - |
組別 | 胚胎重量（克） | 胚胎長度（厘米） |
對照組 | 0.23±0.17 | 0.84±0.23 |
低劑量組 | 0.16±0.06 | 0.56±0.13 |
高劑量組 | 0.10±0.08** | 0.23±0.12*** |
米非司酮組 | 0.04±0.06 | 0.18±0.07 |
說明：**P＜0.05；***P＜0.01。 | ||
組別（克/升） | 培養液中HCG量（毫克/升） | ||
24小時 | 48小時 | 72小時 | |
對照組 | 0.48±0.12 | 0.88±0.08 | 1.21±0.11 |
10 | 0.45±0.13 | 0.66±0.23 | 0.83±0.08 |
20 | 0.39±0.11 | 0.30±0.04 | 0.13±0.06 |
40 | 0.32±0.05 | 0.08±0.02 | 0.06±0.01 |
表4：加藥後48小時SDH酶組化及HCG免疫組化反應平均A值及抑制率（X±S） | ||||
組別（克/升） | SDH酶組化反應 | HCG免疫組化反應. | ||
平均A值 | 活性抑制率（％） | 平均A值 | 活性抑制率（％） | |
對照組 | 17.6±5.2 | 0 | 53.4±9.8 | 0 |
10 | 14.2±2.7 | 19.9 | 48.7±6.9 | 10.6 |
20 | 4.7±1.3 | 73.4 | 17.2±2.8 | 67.8 |
40 | 2.0±0.9 | 88.6 | 9.9±1.4 | 81.5 |
SDH活性抑制率及HCG合成抑制率均由：
算出。
榮譽表彰
2005年，《馬鞭草提取物及其製法和用途》獲得第四屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
