馬肝醇脫氫酶(Horse hepatic alcohol dehydrogenase，HLADH)是常用的脫氫酶，其底物專一性不強，因而可催化多種底物還原，套用廣，缺點是立體選擇性不高。HLADH是由兩個亞基組成的二聚體，每個亞基含有兩個鋅離子。該酶的三維空間結構已由X射線衍射法確定。
基本介紹
- 中文名：馬肝醇脫氫酶
- 外文名：Horse hepatic alcohol dehydrogenase
- 縮寫：HLADH
- 本質：脫氫酶
- 結構：兩個亞基組成的二聚體
- 缺點：立體選擇性不高
簡介,馬肝醇脫氫酶在大腸桿菌中的表達,
簡介
馬肝醇脫氫酶(Horse hepatic alcohol dehydrogenase，HLADH)是常用的脫氫酶，其底物專一性不強，因而可催化多種底物還原，套用廣，缺點是立體選擇性不高。HLADH是由兩個亞基組成的二聚體，每個亞基含有兩個鋅離子。該酶的三維空間結構已由X射線衍射法確定。
馬肝醇脫氫酶可與酵母醇脫氫酶(YADH)的一級結構差別很大，但它們的四級結構非常相似。HLADH的最大用途是還原中等大小的單環酮(四到九元環)和雙環酮，無環酮被還原時的立體選擇性低，具有空間位阻和分子結構大於萘烷的酮不宜作為該酶的底物。
具有空間位阻的籠狀多環酮能被選擇性還原。2—三環癸酮(2—twistanone)消旋體被HLADH還原後，產生外醇和未反應的對映體酮，其對映體過量率分別為e.e.90%和e.e.68%，見圖1。
圖1
圖1一些單環酮和雙環酮消旋體已被HLADH所拆分，催化反應具有極高的對映體選擇性。O或S取代的雜環酮也是HLADH的適宜底物，例如8—位氧或硫取代的消旋體(土)—二環壬烷—3—酮能被HLADH還原拆分，見圖1。但是8—位N取代的這種環酮卻不能被拆分，這是由於含氮底物與酶分子活性中心的Zn2+形成配位鍵，而使酶喪失活性。
馬肝醇脫氫酶(HLADH)能催化消旋體2—烷基噻喃—4—酮的還原，酶使H+僅從si面進攻羰基，產生一個反式一(S)一醇和順式—(S)一醇。非對映體醇可用色譜法加以分離，然後再被氧化成光學活性的酮，從而將消旋體拆分，見圖2。
圖2
圖2二環或多環酮分子中的橋頭碳原子不能發生消旋化而使構型保留，因此HLADH催化內消旋體順式十氫萘—2，7—二酮、反式十氫萘一2，6一二酮和無手性1，2，3，4，5，6，7，8一八氫萘—2，6—二酮還原後產生具有高度光學活性(S)一醇，產物的對映體過量率大於98%，見圖3。
HLADH還能催化具有軸手性金屬有機化合物的立體選擇性還原拆分。消旋體三羰絡(鄰甲基環戊二烯甲醛)錳金屬有機物可被對映選擇性地還原為限(R)一醇和未反應(S)一醛，它們均具有很高的光學活性，見圖4。另外，消旋體三羰絡(鄰取代苯甲醛)鉻金屬有機物也可被HLADH在pH值為7的條件下，含吐溫80(Tween80)的緩衝液中催化還原拆分。36℃反應8小時，醇和醛的產率約為80%，對映體過量率為80%～90%。
圖3
圖3
圖4為了預測HLADH催化還原反應的立體化學，人們提出了一些模型。最近發展的立方體模型(cubic—space descriptor)對手性中心遠離羰基的酮還原結果的預測更為準確，該模型認為平面環己酮的羰基氧原子與酶活性中心的Zn2+離子形成配位鍵，H+從空間位阻較小的底面向羰基發生親核進攻，見圖5。
圖5馬肝醇脫氫酶在大腸桿菌中的表達
編碼的胺基酸序列與文獻報導的完全相同。在利用基因工程的方法表達馬肝醇脫氫酶過程中，可能是啟動子的影響，存在不表達和包涵體表達的情況，研究先後嘗試使用了pET20b(+)，pET30a，pTre99a，pkk223—3等表達載體，在利用載體pkk223-3在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達時，經檢測產物有可溶性表達，並且均有氧化環己醇的活性，其中E型活性強於s型。最後，將馬肝醇脫氫酶E型和s型基因c端分別連線His tag，利用載體pkk223—3在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，從而使馬肝醇脫氫酶表達產物可以用鎳柱進行親和純化。實驗中重組HLADH—E和HLADH—S的活性與文獻中相似，純化後的比活性高於文獻中的結果，這可能是親和純化後的酶純度高，並且親和純化的過程短，對蛋白活性的保持好的原因。 研究不但實現了馬肝醇脫氫酶的可溶性表達，還利於表達後的分離純化，為馬肝醇脫氫酶的進一步研究和套用奠定了良好的基礎，相關研究正在進行。
