《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》是南京振中生物工程有限公司於2003年3月4日申請的專利，該專利的申請號為031129080，公布號為CN1437019，授權公布日為2003年8月20日，發明人是程光、程培元、張偉東、方貽功。
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》是建立一種普適校正法測定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布的方法。該方法，其特徵在於：採用高效凝膠滲透色譜法－HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5摩爾/升硝酸鈉，0.1～0.5摩爾/升醋酸鈉和磷酸鹽緩衝溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用1～4根，分離範圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1毫升/分鐘～1.0毫升/分鐘；繪製HPGPC相對標準曲線的標準物質可以是Dextran或者Pullulan；繪製HPGPC普適校正曲線的標準物質為香菇多糖的分級分離產品。
2013年，《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
（概述圖為《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：香菇多糖分子量及分子量分布測定方法
- 公布號：CN1437019
- 公布日：2003年8月20日
- 申請號：031129080
- 申請日：2003年3月4日
- 申請人：南京振中生物工程有限公司
- 地址：江蘇省南京市高新技術產業開發區
- 發明人：程光、程培元、張偉東、方貽功
- Int.Cl.：G01N30/02、G01N30/36、G01N30/46、G01N24/08、G01N21/35
- 代理機構：南京蘇科專利代理有限責任公司
- 代理人：徐冬濤
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
香菇多糖是2003年3月前廣泛套用於抗腫瘤化療及放療的一種生物反應調節劑（Biological Response Modifier，BRM）。特別是套用於胃癌、肺癌、腸癌、乳腺癌具有明顯的化療增效及降低化療及放療的毒副作用，對其他腫瘤的化療均有不同程度的增效及降低毒副作用。香菇多糖是以β-D-（1→3）葡萄糖為主鏈，β-D-（1→6）葡萄糖為側鏈的葡聚糖，為多分散性的高聚物。研究發現香菇多糖分子量與動物乃至臨床抗腫瘤活性有著相關關係，因此，研究香菇多糖分子量的測定方法對控制香菇多糖內在質量具有重要意義。然而，2003年3月前測定大分子多糖分子量的方法所採用的標準物質往往與被測物質的化學結構不相同，由此建立的為相對標準曲線，所測結果為相對分子量，與所測物質的實際分子量有較大的誤差。因此，需要建立一種適合工業生產的香菇多糖分子量及其分布的測定方法。
發明內容
專利目的
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》的目的是建立一種普適校正法測定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布的方法。
技術方案
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》的原理系根據Mark-Houwink經驗公式[η＝KM]來進行的，式中η為特性粘數，M為分子量，K、α為係數。
一、該發明產品香菇多糖的分子量、分子式、化學結構式
1、分子量測定
經高效凝膠滲透色譜，採用普適校正曲線方法測定分子量大多在40～80萬之間。
2、碳核磁共振譜（見表1）
C | 香菇多糖（天地欣） | 日本產香菇多糖 | 解析 |
1 | 104.6 | 104.6 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
2 | 74.5 | 74.3 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
3 | 87.7 | 87.7 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
4 | 70.2 | 70.2 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
5 | 77.8 | 77.9 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
6 | 62.5 | 62.5 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
1′ | 104.9 | 104.6 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
6' | 71.5 | 71.5 | β-D-（1→3）葡萄糖 |
3、紅外光譜圖（見圖1）
4、分子式
經微量元素分析結果表明，分子式為（C6H10O5）n
5、化學結構式
經高碘酸氧化及Smith降解等化學反應結合光譜分析法，香菇多糖的一級結構式如下：
該發明的目的可以通過以下措施來達到：一種香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於：採用高效凝膠滲透色譜法—HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5摩爾/升硝酸鈉，0.1～0.5摩爾/升醋酸鈉和磷酸鹽緩衝溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用一～四根，分離範圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1毫升/分鐘～1.0毫升/分鐘；繪製HPGPC相對標準曲線的標準物質可以是Dextran或者Pullulan；繪製HPGPC普適校正曲線的標準物質為香菇多糖的分級分離產品。
該發明的目的還可以通過以下措施來達到：採用普適校正的標準曲線來測定香菇多糖的分子量及其分布；採用鹼液溶解香菇多糖；所用鹼液可以是氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉；所用鹼液的濃度可以是0.1～1摩爾/升NaOH，0.1～1摩爾/升KOH，0.5～1摩爾/升Na2CO3，0.1～1摩爾/升NaHCO3；HPGPC的流動相選用0.1摩爾/升的醋酸鈉和磷酸鹽緩衝液為好；所述的醋酸鈉和磷酸鹽的pH可以是6.0～8.0；HPGPC的分析柱最佳化的組合方式為三根不銹柱串聯，分離範圍為2,000,000～1000道爾頓；
HPGPC分析柱的優選柱溫以30℃為佳；HPGPC的流速保持0.4毫升/分鐘為佳；香菇多糖分級分離產品的重均分子量道爾頓分別為：1、62.4×10，2、53.4×10，3、18.4×10，4、10.6×10，5、7.72×10；測得香菇多糖K值為0.0535～0.0543，α值為0.6～0.8；最佳化的香菇多糖K值為0.0539，α值為0.607。
改善效果
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》採用普適校正曲線對香菇多糖分子量進行校正所獲得的分子量及分子量分布與用光散射法所測結果相似，誤差較小，精確度提高。
附圖說明
圖1是《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》的香菇多糖的紅外光譜圖；
圖2是該發明HPGPC檢測系統重現性顯示圖。
權利要求
1、《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》特徵在於：採用高效凝膠滲透色譜法—HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5摩爾/升硝酸鈉，0.1～0.5摩爾/升醋酸鈉和磷酸鹽緩衝溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用一～四根，分離範圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1毫升/分鐘～1.0毫升/分鐘；繪製HPGPC相對標準曲線的標準物質可以是Dextran或者Pullulan；繪製HPGPC普適校正曲線的標準物質為香菇多糖的分級分離產品。
2、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於採用普適校正的標準曲線來測定香菇多糖的分子量及其分布。
3、根據權利要求2所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於採用鹼液溶解香菇多糖。
4、據權利要求3所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於所用鹼液可以是氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉。
5、根據權利要求4所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於所用鹼液的濃度可以是0.1～1摩爾/升NaOH，0.1～1摩爾/升KOH，0.5～1摩爾/升Na2CO3，0.1～1摩爾/升NaHCO3。
6、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於HPGPC的流動相選用0.1摩爾/升的醋酸鈉和磷酸鹽緩衝液為好。
7、根據權利要求6所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於所述的醋酸鈉和磷酸鹽的pH可以是6.0～8.0。
8、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於HPGPC的分析柱最佳化的組合方式為三根不銹銅柱串聯，分離範圍為2,000,000～1000道爾頓。
9、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於HPGPC分析柱的優選柱溫以30℃為佳。
10、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於HPGPC的流速保持0.4毫升/分鐘為佳。
11、根據權利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於香菇多糖分級分離產品的重均分子量道爾頓分別為：1、62.4×10，2、53.4×10，3、18.4×10，4、10.6×10，5、7.72×10。
12、根據權利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於採用香菇多糖分級分離產品測得香菇多糖K值為0.0535～0.0543，α值為0.6～0.8。
13、根據權利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特徵在於最佳化的香菇多糖K值為0.0539，α值為0.607。
實施方式
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》的實施步驟是採用市場上可購得的標準物質Pullulan系列或右旋糖酐（Dextran）系列分別測定相對標準曲線，並計算K、α值。
該發明進一步地採用香菇多糖分級分離產品測定其特性粘數，並用光散射法測定其分級分離品的分子量，建立普適校正曲線，建立以Dextran或Pullulan為標準的通用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定香菇多糖分子量及其分布的方法。
該發明是建立在二十五批香菇多糖（商品名：天地欣，下同）分子量及分子量分布（簡稱分布，下同）實驗研究所得數據的基礎上的。參見表2K、α值的數據統計表。
香菇多糖K、α值的測定：為了測定香菇多糖K、α值，選取五個不同分子量的香菇多糖分級分離樣品，用光散射法測定分子量：62.4×10、53.4×10、18.4×10、10.6×10、7.72×10。依據中國藥典（2000年版）附錄的規定，在0.1摩爾/升醋酸鈉和磷酸鹽緩衝液（pH7.8～8.0）、30℃條件下測定特性黏數，套用η＝KM公式計算K、α值，共測定了25組K、α值（每次新配磷酸鹽緩衝液並測定pH值，詳細數值見下表），分別計算K、α的算術平均值和標準偏差，用Grubbs檢驗法判斷數值的取捨。
次數 | 磷酸鹽緩衝液pH值 | K | α |
1 | 7.89 | 0.0540 | 0.605 |
2 | 7.91 | 0.0538 | 0.607 |
3 | 7.93 | 0.0540 | 0.606 |
4 | 7.86 | 0.0538 | 0.607 |
5 | 7.88 | 0.0541 | 0.609 |
6 | 7.90 | 0.0536 | 0.604 |
7 | 7.84 | 0.0535 | 0.609 |
8 | 7.92 | 0.0537 | 0.610 |
9 | 7.87 | 0.0539 | 0.609 |
10 | 7.90 | 0.0537 | 0.609 |
11 | 7.91 | 0.0540 | 0.608 |
12 | 7.89 | 0.0537 | 0.609 |
13 | 7.90 | 0.0536 | 0.610 |
14 | 7.86 | 0.0536 | 0.608 |
15 | 7.94 | 0.0540 | 0.608 |
16 | 7.97 | 0.0542 | 0.607 |
17 | 7.84 | 0.0538 | 0.605 |
18 | 7.92 | 0.0540 | 0.605 |
19 | 7.90 | 0.0538 | 0.602 |
20 | 7.95 | 0.0540 | 0.608 |
21 | 7.81 | 0.0543 | 0.608 |
22 | 7.97 | 0.0538 | 0.607 |
23 | 7.87 | 0.0538 | 0.610 |
24 | 7.95 | 0.0537 | 0.606 |
25 | 7.89 | 0.0540 | 0.607 |
平均值 | 7.90 | 0.0539 | 0.607 |
標準差 | 0.0404 | 0.000200 | 0.00201 |
《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》還採用雷射光散射法直接測定6個批號香菇多糖重均分子量進行覆核。結果表明兩種方法所測的數據近似，誤差較小。實施例1儀器：高效凝膠滲透色譜儀為美國Waters公司工作站系統，510泵，410示差折光檢測器，Millennium2010系統軟體和GPC專用軟體。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。（1）色譜柱選用凝膠色譜柱時可選用分離範圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱，可採用三根不鏽鋼柱串聯。例如：Ultrahydrogel1000，500和250。（2）流動相先後以超純水（電阻為18.2M），0.1摩爾/升的醋酸鈉和磷酸鹽緩衝溶液（pH＝7.8，按照2000年版中國藥典附錄配製）為流動相，根據樣品的溶解度、折光率、出峰時間和峰形等因素，最佳化選用磷酸鹽緩衝溶液pH＝7.8為佳。（3）柱溫先後比較了30℃、35℃、45℃、55℃時的HPGPC圖譜，其中以35℃、30℃較好，尤以30℃的圖譜更佳。（4）流速比較了0.2毫升/分鐘、0.4毫升/分鐘、0.6毫升/分鐘、0.8毫升/分鐘、1.0毫升/分鐘時的HPGPC圖譜均可，但以0.4毫升/分鐘為優。（5）進樣量比較了100微升、200微升、300微升的HPGPC的圖譜較好，但以200微升為優。（6）相對標準曲線的繪製選用標準物質Dextran系列五個，其分子量為17.5×10、74.95×10、41.00×10、27.3×10、4.86×10；或Pullulan系列：74.9×10、38×10、21.2×10、10×10、4.8×10、2.37×10亦可。上述標準物質Dextran其在30口的特性粘數分別為74.8、57.1、48.6、35.5、23.0。根據公式η＝KM，計算標樣Dextran的K、α值。根據Dextran的K、α值繪製相對標準曲線。（7）普適校正曲線的繪製用5個已知分子量和特性粘數的Dextran標樣，配成1毫克/毫升濃度的溶液，注入高效液相儀，按公式lgη＝lgK+αlgM，計算出K和α值。輸入計算機，由GPC軟體繪製lg[η]M-V0（淋出體積）的標準曲線，將香菇多糖的K值、α值輸入計算機，得到普適校正曲線，香菇多糖的K值及α值由下述（8）敘述。（8）香菇多糖分級分離產品及其分子量的測定1）香菇多糖分級產品的分離、純化參見Nature1965222687-8頁。所得純化的分級產品用光散射法（由國家技術監督局標準物質研究中心測定）測得五個產品的分子量分別為：62.4×10、53.4×10、18.4×10、10.6×10、7.72×10。上述分級分離產品分別按中國藥典2000年版二部附錄38頁VIG第三法測定其特徵粘數。2）香菇多糖K、α值的測定。根據公式η＝KM，測得香菇多糖在上述流動相體系下的K值為0.0539，α值為0.607。香菇多糖K、α值根據25組實驗測定的數據確定的。參見表2。
（9）香菇多糖HPGPC法測定分子量及其分布香菇多糖供試品5毫克加0.5摩爾/升的氫氧化鈉溶液0.5毫升溶脹，再用0.5摩爾/升的鹽酸調pH至7.0～8.0，用水定容至5毫升搖勻，用0.45μ濾膜過濾即得。吸取上述香菇多糖供試品溶液200微升，注入凝膠色譜儀，流速0.4毫升/分鐘，記錄色譜圖。即得普適校正曲線校正後的香菇多糖分子量及其分布圖譜。見表3、4。
表3：香菇多糖（天地欣）一批分子量累積重量分布曲線分片統計表
Slice Table showing 40 of 3877 slices | |||
# | Cumulative%（%） | MolWt（Daltons） | Retention Time（分鐘） |
1 | 0.061 | 1707673 | 33.333 |
2 | 0.449 | 1496554 | 34.140 |
3 | 3.015 | 1311536 | 34.948 |
4 | 9.061 | 1149391 | 35.755 |
5 | 15.813 | 1007293 | 36.562 |
6 | 21.926 | 882762 | 37.370 |
7 | 27.394 | 773626 | 38.178 |
8 | 32.402 | 677983 | 38.985 |
9 | 37.043 | 594164 | 39.792 |
10 | 41.387 | 520708 | 40.600 |
11 | 45.514 | 456333 | 41.407 |
12 | 49.470 | 399917 | 42.215 |
13 | 53.210 | 350476 | 43.022 |
14 | 56.786 | 307146 | 43.830 |
15 | 60.219 | 269174 | 44.637 |
16 | 63.554 | 235896 | 45.445 |
17 | 66.759 | 206732 | 46.252 |
18 | 69.813 | 181174 | 47.060 |
19 | 72.661 | 158776 | 47.867 |
20 | 75.277 | 139146 | 48.675 |
21 | 77.721 | 121944 | 49.482 |
22 | 79.946 | 106868 | 50.290 |
23 | 82.033 | 93656 | 51.097 |
24 | 83.981 | 82077 | 51.905 |
25 | 85.793 | 71930 | 52.712 |
26 | 87.524 | 63037 | 53.520 |
27 | 89.191 | 55244 | 54.327 |
28 | 90.757 | 48414 | 55.135 |
29 | 92.273 | 42429 | 55.942 |
30 | 93.713 | 37183 | 56.750 |
31 | 94.999 | 32586 | 57.557 |
32 | 96.067 | 28558 | 58.365 |
33 | 96.971 | 25027 | 59.172 |
34 | 97.721 | 21933 | 59.980 |
35 | 98.338 | 19222 | 60.787 |
36 | 98.839 | 16845 | 61.595 |
37 | 99.277 | 14763 | 62.402 |
38 | 99.624 | 12938 | 63.210 |
39 | 99.875 | 11338 | 64.017 |
40 | 100.000 | 9936 | 64.825 |
（10）普適校正曲線的可靠性和準確性評價見表4。
原料批號 | 重均分子量（Mw）（單位：萬） | 相對偏差（%） | |
HPGPC法 | 光散射法 | ||
1 | 60.0 | 57.5 | 2.1 |
2 | 50.2 | 53.0 | 2.7 |
3 | 70.4 | 71.8 | 1.0 |
4 | 56.6 | 61.0 | 3.7 |
5 | 57.7 | 59.7 | 1.7 |
6 | 54.9 | 52.2 | 2.5 |
（11）HPGPC檢測系統重現性考察為考察HPGPC系統的重現性，將一批註射用香菇多糖（天地欣）重複進樣5次，其結果見圖2和表5。
次數/參數 | 第一次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | 第五次 | X±RSD |
ST（分鐘） | 31.742 | 31.317 | 31.192 | 31.108 | 31.650 | 31.402±0.80% |
RT（分鐘） | 36.325 | 36.350 | 36.450 | 35.467 | 36.358 | 36.190±1.00% |
Mw（萬） | 58.0 | 58.2 | 56.0 | 56.1 | 55.8 | 56.8±1.90% |
Mn（萬） | 15.4 | 17.1 | 13.3 | 17.6 | 15.9 | 16.2±5.06% |
（12）數據處理採用Waters公司提供的Millennium2010系統軟體和GPC專用軟體，以上軟體均獲美國FDA認可。
榮譽表彰
2013年，《香菇多糖分子量及分子量分布測定方法》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
