《食用真菌組合表達紫杉醇及其中間產物的基礎研究》是依託華南農業大學，由林俊芳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：食用真菌組合表達紫杉醇及其中間產物的基礎研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：林俊芳
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本項目基於食用菌與目前人類發現的能夠生物合成紫杉醇的真菌都是絲狀真菌、具有紫杉醇等萜類化合物生物合成途徑或代謝補償途徑的認識，套用系統生物學理論和合成生物學工程與代謝工程技術，計畫利用本項目組已經克隆的南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉中紫杉醇生物合成途徑的所有二十個基因，採用酶法組裝新技術，構建紫杉醇生物合成基因的多個單基因表達盒的組合表達載體和多基因表達盒的組合表達載體，多載體共轉化食用菌金針菇、銀耳、靈芝、猴頭菇、蛹蟲草，篩選組合表達紫杉醇或其中間產物的食用菌多基因轉化子，最佳化紫杉醇或其中間產物在食用菌多基因轉化子中的組合表達條件、揭示多基因組合表達規律，研究闡明紫杉醇生物合成基因在食用菌多基因轉化子中的遺傳規律。為利用食用菌組合表達抗癌特效藥紫杉醇或其中間產物奠定科學基礎、提供技術支撐。對緩解紫杉醇藥源緊缺和供需矛盾、揭示食用菌萜類化合物生物合成機理具有重大意義和價值。
結題摘要
紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉樹皮中提取出來的一種具有獨特抗腫瘤作用的二萜類天然產物，含量極低，其代謝途徑中目前已知的關鍵酶基因有13個。本項目從曼地亞紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉中克隆得到了紫杉醇合成途徑中的12個關鍵酶基因，採用金針菇、灰蓋鬼傘、靈芝、銀耳、猴頭菇等對克隆的基因進行了表達，同時採用大腸桿菌為宿主表達了DBAT基因並嘗試構建無細胞催化體系，獲得了以下重要研究結果： （1）紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因在灰蓋鬼傘中的表達。首次以灰蓋鬼傘為表達宿主，引入紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因GGPP合酶基因（ggpps）和紫杉烯合酶基因（ts），研究結果表明引入單基因ggpps灰蓋鬼傘工程菌株能夠表達出目標產物GGPPS,而引入單基因ts沒有檢測到目標產物。同時引入ggpps和ts的組合表達載體獲得的雙基因工程菌株，檢測結果表明了灰蓋鬼傘成功組合表達了目標產物紫杉烯。把紫杉醇合成途徑中的第13號關鍵酶基因10-去乙醯巴卡亭Ш乙醯轉移酶基因(DBAT)引入灰蓋鬼傘中，結果表明灰蓋鬼傘能正確表達該酶。 （2）紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因在金針菇中的表達。首次以金針菇為宿主菌引入10-去乙醯巴卡亭Ш乙醯轉移酶（DBAT）基因進行表達，獲得了金針菇工程菌株，經檢測結果表明金針菇菌絲里表達了目標產物。同時，採用同樣的方法把紫杉烯合酶基因ts轉化進金針菇獲得了轉基因菌株。 （3）紫杉烯合酶基因ts在靈芝和猴頭菇中的表達。首次以美國靈芝和猴頭菇為表達宿主，引入紫杉烯合酶基因ts，獲得了轉基因靈芝和猴頭菇菌株，結果表明了轉基因靈芝檢測到了表達產物。 （4）紫杉醇代謝途徑中相關多基因表達載體的構建。採用一步等溫法及改良法創造性地構建了2個基因、3個基因和4個基因的組合表達載體。 （5）紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因在銀耳芽孢中的組合表達。以銀耳芽孢為受體細胞，利用組合表達載體在銀耳芽孢中表達紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因，結果表明銀耳芽孢成功表達了單基因ggpps的產物GGPPS、雙基因ggpps和ts基因串聯組合表達出紫衫二烯，三個基因ggpps、ts和T5aOH基因組合表達出紫杉二烯-5α-醇（紫杉醇的中間產物）。 （6）嘗試構建紫杉醇代謝途徑中關鍵酶的無細胞催化體系。採用原核表達宿主表達DBAT基因，獲得純酶，研究了酶的性質並在體外進行催化實驗。
