靶向胱硫醚γ-裂解酶抑制劑的發現及作用機制研究

《靶向胱硫醚γ-裂解酶抑制劑的發現及作用機制研究》是依託上海交通大學，由胡有天擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：靶向胱硫醚γ-裂解酶抑制劑的發現及作用機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：胡有天
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

藥物篩選是發現疾病靶標高效先導化合物的重要途徑之一。胱硫醚γ-裂解酶（CSE）是氣體信號分子硫化氫合成的關鍵酶之一，其具有重要的生理功能，並且與多種疾病的發生相關，因此是新型的藥物靶點。但是，CSE已知的抑制劑活性低、選擇性差，不利於其在科學研究和臨床中的套用。本項目擬基於我們新構建的硫化氫檢測模型，建立靶向CSE抑制劑的高通量篩選方法，並通過藥物篩選從美國國立癌症研究所（NCI）化合物庫、天然產物庫等化合物庫中，獲得靶向CSE的高效、高選擇性的抑制劑; 結合藥物設計和定點突變等技術手段，闡明新型抑制劑調控CSE的分子機制; 通過細胞實驗，研究抑制劑在細胞水平的有效性和生物學效應。本項目的研究成果將為胱硫醚γ-裂解酶的結構-功能關係研究提供研究工具，同時為CSE相關疾病的藥物研究奠定基礎。

結題摘要

胱硫醚γ-裂解酶（CSE）是氣體信號分子硫化氫合成的關鍵酶之一，其具有重要的生理功能，並且與多種疾病的發生相關，因此是新型的藥物靶點。但是，CSE已知的抑制劑活性低、選擇性差，不利於其在科學研究和臨床中的套用。本項目建立胱硫醚γ-裂解酶的小分子抑制劑的篩選平台，並基於此發現靶向 CSE 的抑制劑。我們基於192串聯雙孔板的胱硫醚γ-裂解酶的小分子抑制劑高通量篩選平台的建立，並對其進行最佳化。隨後，從美國國立癌症研究所化合物庫、美國聯邦食品藥品監督管理局批准的藥物庫、商品化的Maybridge化合物庫等化合物庫和天然產物庫共11954種化合物進行了篩選，發現了30個對CSE酶的半數抑制濃度IC50值在50 μM以內的抑制劑。其中，NSC4056的抑制活性最好（IC50 = 0.6 μM），並且對另外兩種維生素B6依賴性酶胱硫醚β-合酶和多巴脫羧酶表現出選擇性。通過硫化氫吸收實驗、去垢劑干擾實驗、質譜、反應活性氧檢測和亞甲基藍實驗，我們證實NSC4056確實是CSE酶的抑制劑，而不是“假陽性”的抑制劑。通過稀釋法，我們發現是NSC4056是靶向CSE的非共價抑制劑。通過等溫滴定實驗，我們證實了NSC4056能夠直接結合在CSE酶上，且結合比率為1：1。通過酶動力學實驗，我們發現NSC4056是通過競爭底物L-Cys的結合位點從而抑制CSE酶活力。通過分子對接，我們發現CSE酶Arg62, Tyr114和Arg119與NSC4056的羧基氧存在著氫鍵作用，並通過定點突變和合成、購買獲得的NSC4056結構類似物的酶活實驗加以驗證。通過硫化氫影像、醋酸鉛試紙和質譜，我們證實NSC4056能夠抑制巨噬細胞Raw264.7內源性CSE產生的硫化氫氣體,且活性優於已知抑制劑PAG。通過構建CSE突變體及CBS過表達的HEK293T 細胞系，我們證實了NSC4056在細胞水平能夠選擇性抑制CSE酶的活力。在失血性休克大鼠模型中，NSC4056能夠有效抑制硫化氫的升高，並且緩解大鼠的低血壓症狀，證明了其在動物水平的有效性。該項目的完成為CSE酶的功能研究提供工具，為相關疾病治療提供先導化合物。