非病毒載體

非病毒載體是利用非病毒的載體材料的物化性質來介導基因的轉移。非病毒載體具備無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學結構可控制，且易於大量製備，在表達質粒、反義寡核苷酸或反義表達質粒真核細胞的靶向轉移中，有著病毒載體不可替代的作用。

基本介紹

• 中文名：非病毒載體
• 外文名：Non viral vector
• 特點：無傳染性
• 常用材料：脂質體或脂類複合物

特點

非病毒載體具備無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學結構可控制，且易於大量製備，在表達質粒、反義寡核苷酸或反義表達質粒真核細胞的靶向轉移中，有著病毒載體不可替代的作用。

與病毒載體相比較，具有毒性低、免疫反應低，而且所攜帶的基因不整合至宿主細胞基因組等優點。

然而，非病毒載體的轉導效率低，目的基因只能實現瞬間表達，其運送系統的顆粒較大，容易引發免疫反應和被機體所清除。

常用材料

脂質體複合物

脂質體包括陽性、中性和陰性脂質體,其中陽性脂質體研究的最為廣泛。自從1987年以來, 眾多學者相繼合成出許多陽離子脂質體。所有的陽離子脂質體的一端皆擁有1~2條由12~ 18個碳原子組成的疏水鏈, 使其在水性介質中形成雙層結構, 並包裹DNA;另一端為親水性的N+, 通過靜電力與DNA結合以形成脂質複合物。

脂質體或脂質複合物經靜脈注射後,很快被血漿清除並在肺組織中積蓄, 蛋白質主要在肺內皮細胞中表達，通常表達時間較短,一般在給藥後4~ 24h即達峰, 1周后消失。因此,陽離子脂質載體在治療一些肺部疾病如肺代謝性疾病、門脈高壓和急性呼吸窘迫綜合徵等有較好前景。脂質體或脂質複合物也可直接套用於病變部位以避免靜脈給藥選擇性差的缺點。

目前雖然在陽離子脂質體構效關係研究的基礎上,合成了一些新的脂質載體, 但離理想的脂質載體還相距較遠,其主要困難在於體內外轉染條件的差別, 而且轉染效果還取決於給藥途徑。因此, 只有根據實際的臨床套用來個性化設計才能獲得較為理想的載體, 這無疑給載體的開發帶來困難。脂質體或脂質複合物並沒有長期安全性報導。

陽離子多聚物

1、多聚賴氨酸：聚L-賴氨酸和去唾液酸糖蛋白連線的聚合物用於細胞的基因靶向轉移, 其基因轉染效果較陽離子脂質體差。有研究表明，在有或無靶向配體的情況下，多聚賴氨酸與DNA的聚合物的細胞攝取率和基因轉染率都依賴於聚合複合物正電性的存在。

2、聚乙烯亞胺( polyethylenimine, PEI) ：PEI陽離子聚合物表面的正電荷與DNA上帶負電荷的磷酸基團產生靜電作用形成複合物。這種複合物的超分子結構可以描述為一種核-殼結構, 疏水核是部分中和的DNA,外殼則是親水的陽離子聚合物鏈段。這種核-殼結構,增加了體系在血液循環中的穩定性, 保護DNA在傳遞過程中不受DNA酶或巨噬細胞的降解。PEI陽離子聚合物由於其自身具有緩衝容量, 在不需要加入吞噬細胞或溶酶體溶解劑的情況下就顯示出較好的基因轉染效果。

3、樹突狀聚合物：樹突狀聚合物系一定Mr 範圍的聚醯胺和含磷樹狀聚合物的末端氨基通過靜電力與DNA結合形成的一種陽離子多聚物非病毒基因載體，聚醯胺樹狀聚合物的醯胺鍵在水或乙醇中的水解,可使基因轉染率增加50倍, 其原因可能是水解增加了聚合物的柔韌性。故一些可水解的聚醯胺樹狀聚合物對體內頸動脈的基因轉染比支鏈PEI更有效。

殼聚糖聚合物

殼聚糖作為一種天然陽離子聚合物,通過與DNA以靜電方式作用使殼聚糖-DNA體系不被降解, 完全進入細胞。作為基因載體, 殼聚糖具有細胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和轉染效率較高等特點。

殼聚糖-DNA複合物按製備方法主要分殼聚糖及其衍生物的DNA複合物、殼聚糖-DNA納米微球和殼聚糖自聚體-DNA。有研究表明，殼聚糖的Mr、DNA複合物的N/P值、DNA複合物顆粒大小和對殼聚糖的改性及其改性程度是影響這類DNA複合物對細胞的轉染效率和是否對特定細胞具有靶向性的主要因素。殼聚糖載體對質粒DNA有效的凝聚作用和保護DNA不被核酸酶降解是其它高分子載體無法比擬的。

無機納米粒子

套用於基因轉運的無機納米粒子主要包括矽、鐵氧化物、碳納米管、磷酸鈣、金屬納米粒子、量子點等。無機納米粒子主要通過穿過細胞膜將藥物或生物分子轉運到生物體中而起到治療疾病的作用, 其發揮轉染功能的大致過程有：首先,將DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,通過內吞入胞等方式被轉運至細胞內並且被釋放。其次,將DNA導入細胞核並發揮功能。

但目前沒法確定DNA進入細胞核的確切途徑,學者們主要傾向於兩種主要理論: 一種是納米粒子在內涵體或細胞質中被溶解, 然後釋放DNA轉運進核; 另一種是攜帶DNA的納米粒子直接到達細胞核表面,然後DNA轉運進核。

克服的屏障

非病毒載體克服的基因轉染效率很低。這主要是非病毒載體介導基因治療需要克服3道屏障：細胞膜、內涵體-溶酶體系統、核膜。

要提高非病毒載體基因轉染效率，就必須要使載體能有效的跨越細胞膜即增強細胞對複合物的攝取; 其次要保護基因不受內涵體溶酶體系統酸性環境的破壞降解，並能使內涵體溶酶體有效的釋放基因; 最後，基因要進入細胞核表達目的蛋白就必須要能有效的跨越核膜。

提高細胞載體

為提高攝取率，就要提高複合物的細胞靶向性，增強與細胞膜的作用。

1、連線靶向配體

在非病毒載體骨架上接上配體，與相應的細胞表面受體特異性結合，加強複合物的細胞靶向，增加細胞對複合物的攝取，從而增加基因的表達。

轉鐵蛋白是一種內源性的糖蛋白，多數腫瘤細胞過表達轉鐵蛋白受體，在載體上接入轉鐵蛋白可提高納米複合物的癌細胞靶向性，增加細胞對複合物的攝取率從而增強基因的表達。

2、載體材料的結構修飾

載體材料是攜帶基因達到靶細胞的運輸工具，其結構影響複合物達到靶細胞的效率 通過載體材料的修飾可以改善其溶解性，禁止其過多的表面電荷，降低細胞毒性 另外載體材料結構修飾可以更好的包裹基因，保護基因不被破壞，提高細胞靶向性，增強與細胞膜的作用。

聚乙二醇(polyethyleneglycol ，PEG ) 是親水性很強的聚合物，常用來修飾納米粒載體以改善其水溶性或者禁止其表面電荷，但PEG修飾後的納米粒細胞攝取率很低，這很大程度上限制了PEG在納米載體上的運用。為了克服低轉染效率問題運用低聚PEG修飾載體，這樣可以減小空間位阻有利於細胞的攝取。

3、賦予納米粒“隱形”的特性

基因轉染效率要高，首先要求納米粒能有效的集中於靶細胞，增強靶細胞的攝取 但一般的納米粒粒徑較大，進入體循環後很容易被體內的單核細胞吞噬系統 (MPS) 所吞噬，並在網狀內皮系統（RES） 中聚集，這使得達到靶細胞的納米粒的量極少，導致體內轉染時效率極低。目前發展的隱形納米粒具有粒徑小，水溶性高的特點，能有效的避免MPS的吞噬，減少體循環中的降解。而這種隱形作用，主要取決於納米粒的粒徑大小和水溶性納米粒半徑控制在100nm以下，並採用親水材料修飾形成親水層，可以避免或者減少體內單核細胞吞噬系統的吞噬，使其在體循環中存在時間更長，能有效地轉運到靶器官或組織。

內涵體溶酶體

內涵體溶酶體系統的酸性環境往往導致基因的破壞，其中的核酸酶則會導致基因的降解這都使基因轉染效率大大下降。 因此，保護基因在內涵體溶酶體系統的完整性和促使基因從該系統中的釋放是提高非病毒載體基因轉染效率的行之有效的方法。

1、加入溶酶體酶傾向劑

增載入體基因複合物在內涵體吞噬泡中釋放的一種可行措施是在轉染時加入溶酶體酶傾向劑，如氯喹。研究顯示氯喹能增加基因轉染效率可能包括3種機制：①緩衝吞噬泡中的；②替代複合物中的載體；③ 改變釋放後核酸的生物物理學特性。

2、三元複合物載體材料

為了提高基因轉染的效率可以在原有的納米載體基因複合物的基礎上再接入另一種質子緩衝材料，形成三元複合物，緩衝溶酶體中的酸性環境，提高基因轉染效率。由於接入材料的理化性質，在保護基因不受降解同時使基因易於從內涵體溶酶體中釋放到細胞質中從而提高轉染效率。

提高目的基因

基因治療的第三道屏障是核膜，目的基因能否有效地進入細胞核直接關係到基因的轉染效率。非病毒載體介導的基因轉染效率不高，主要是外源基因難以有效的導入到細胞核，導致基因在細胞質中被核酸酶降解。

核蛋白定位 信號（NLS）是一種富含精氨酸、賴氨酸等鹼性胺基酸的短肽，能有效的介導蛋白或者核酸的跨核膜轉運。目前常用的NLS有魚精蛋白，低相對分子質量的魚精蛋白，SV40大T蛋白 非病毒載體通過NLS修飾後，不僅可以協助基因的跨核膜轉運，同時可以提高細胞攝取率.