DNA是通過異羥基洋地黃毒苷（digoxigenin，Dig）配基標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）隨機插入結合而被標記。dUTP通過間臂連結類固醇半抗原異羥基洋地黃毒苷酸基，形成Dig-dUTP，雜交反應後，雜交的靶DNA通過酶聯免疫法與一個抗體複合物抗異羥基洋地黃毒苷配基鹼性磷酸酶複合物（Dig）Ap結合，接著在5-溴-4氯-3-吲哚磷酸鹽（X-磷酸鹽）和硝基四氮唑藍（NBT）存在下，由酶催化反應，在雜交部位形成藍紫色帶或顆粒。
基本介紹
- 中文名：非放射性Dig-dUTP
- 類型：胺基酸
- 操作：轉移，標記探針等
形成,特點,
形成
dUTP通過間臂連結類固醇半抗原異羥基洋地黃毒苷酸基
特點
1．轉移通過打點吸漬、噬菌斑或Sonthern印跡轉移等方法，把被測的DNA轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜上。
2．標記探針取微型離心管於冰上，依次加入：lμg新鮮變性的DNA；2μl六聚核苷酸混合物；2μl dNTP標記用混合物；加無菌雙蒸水至 19μL；加 lμl DNA聚合酶大片段。37℃保溫 1小時至20小時，加入 2μl EDTA（0.2 mol/L），終止反應，加 2μL 4mol/L LiCl，75μl預冷的乙醇沉澱DNA，- 70℃ 30分鐘或-20℃ 2小時、離心收集沉澱物，真空乾燥後加 50μl TE溶解
。3．預雜交膜放入袋內 68℃預雜交 1小時，每 100cm2膜至少用 20ml預雜交溶液。
4．雜交每100cm2膜用2.5 ml雜交液（雜交溶液用預雜交溶液中加新鮮變性的探針組成），68℃至少雜交6小時。
5．洗膜室溫下用50ml 2×SSC， 0.1%（W/V）SDS洗膜，5分鐘× 2次，68℃用0.1×SSC， 0.1%（W/V）SDS洗膜，15分鐘×2次，晾乾。
6．檢測（1）膜在緩衝液中洗滌1分鐘。（2）緩衝液Ⅰ稀釋抗體結合物至150 mU/ml（l:5000），稀釋後的抗體結合物在4℃只能穩定12小時。（3）膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30分鐘。（4）用緩衝液Ⅰ洗膜15分鐘×2次。（5）在緩衝液Ⅱ中平衡2分鐘。（6）在黑暗條件下，膜與新鮮配製的顯色溶液放塑膠袋內密封或放入合適的盒子內，幾分鐘開始顯色。（7）用50ml緩衝液IV洗膜5分鐘，終止反應。（8）攝影記錄結果。
