非損傷性基因取樣

非損傷性基因取樣(noninvasive genetic sampling ，NGS)，是在不捕獲、觸及，甚至在未親眼見到動物的情況下，收集不同形式的樣品獲取樣品中的DNA。樣品包括毛髮、糞便、尿液、脫落羽毛、含口腔脫落細胞的食物殘渣、鱗片以及卵殼等。由於非損傷性取樣的廣泛性、隨機性和便利性，使其在物種鑑別、個體識別、性別鑑定、種群親緣關係鑑定、種群數量估計等方面得到了廣泛的套用。

基本介紹

• 中文名：非損傷性基因取樣
• 外文名：noninvasive genetic sampling
• 材料：毛髮、糞便、尿液、脫落羽毛
• 特徵：廣泛性、隨機性和便利性
• 套用：物種鑑別、個體識別、性別鑑定
• 學科：動物生理學

取樣方法

糞便

糞便中含有腸道脫落細胞，人們可以從糞便中提取DNA 進行遺傳分析。糞便的非損傷性取樣是最具有潛在價值的。它是所有非損傷性取樣中最簡單而且對野生動物影響最小的一種取樣方法。但此法主要存在兩個問題。第一，糞便中的DNA 存在一定程度的降解。儘管新鮮糞便中含大量腸道脫落細胞，可大大提高遺傳分析的成功率和可行性，但是在實際的野外研究中，獲取新鮮糞便是十分困難的。通常獲取的糞便樣品中DNA 存在嚴重降解。要減緩糞便中目標DNA 的降解，需要有效的保存方法。另一個問題，糞便中含有大量抑制Taq 酶活性的物質，對PCR 擴增效果有一定影響。

利用糞便非損傷性取樣獲取的DNA 進行研究的報導有很多。楊水雲等通過製備小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica) 的陽性模板，配製模擬帶菌糞便，結合糞便非損傷性取樣建立了一套從大熊貓糞便檢測腸道病原菌的基因診斷技術。這種快速鑑別診斷病原菌的技術為患病人畜爭取了治療時間，特別是對大熊貓這樣的珍稀物種意義重大。

毛囊

毛髮的非損傷性取樣已在分子生態學中得到了廣泛的套用。研究中通過蒐集動物脫落或被樹枝刮落的毛髮來進行毛髮的非損傷性取樣。毛髮中的DNA 主要集中在毛囊細胞中。在從動物體上採集或脫落的毛髮中，絕大多數都帶有完整的毛囊。從毛囊中提取DNA，通常採用直接經蛋白酶K 消化後，再用酚-氯仿多次抽提的方法或蛋白酶K 消化與Chelex-100 相結合的方法。

在毛髮中除了毛囊外，還有微量DNA 存在於毛乾的髓質中。然而，從毛乾髓質獲取微量的DNA 要求嚴格的操作，而且提取DNA 所用的毛幹部位距毛根越遠越不容易得到，因此這種方法在實際套用中受到了限制，僅用於沒有毛囊或毛囊已敗壞而毛髮樣品又很難得到的情況。

館藏標本

館藏標本包括了動物乾皮標本、浸泡於福馬林液中的標本組織以及骨骼。從保護遺傳學的角度考慮，首先，館藏標本取樣方便而且相對於糞便和毛囊的非損傷性取樣選材範圍較廣；其次，可利用不同年限的館藏標本對動物的遺傳變異及遺傳多樣性進行研究分析，這樣就為制定相關的保護措施提供了可能。鬣羚(Capricornis sumatraensis)作為國家二級保護動物，近年來，種群數量已經急驟下降，為了澄清這種動物在系統進化和分類上的混亂局面以更好的保護其種群多樣性，崔雨新等對5 份不同種群鬣羚乾皮標本進行DNA 提取，利用mtDNA 細胞色素b 的通用引物成功地擴增出cy t b 的約500 bp 的片段，證明了通過乾皮標本研究動物遺傳分化的可行性。從館藏標本中提取DNA 不僅受到標本性質、保存方式、DNA 樣品性質等因素的影響，還受到提取方法的影響。

口腔脫落細胞

利用口腔脫落細胞作為獲得DNA 的來源的可靠性一直受到關注，而且口腔洗液中的食物殘渣又是否會對DNA 的檢測分析產生影響也是一個值得討論的問題。程家蓉等對用人口腔細胞作為來源提取DNA 做基因多態性分析的可行性做了實驗和分析。除其中一例外，所有口腔細胞樣品均能擴增出目的基因片段，並且所有的食物DNA 全部未被擴增，口腔洗液與相應血液的基因多態性結果一致。因此可以證明口腔脫落細胞用於非損傷性取樣分析是可行可靠的。

脫落羽毛、鱗片、尿液等

除了上文提及的幾種取樣方法外，研究者們還從其他方面入手，對不同形式的動物樣品進行非損傷性取樣。田秀華等對大鴇羽毛的不同部位的DNA 提取進行研究，發現羽髓、羽鞘和羽根可以提出一定純度的核DNA 和mtDNA，實心羽莖可以提出一定純度m t-DNA。還有報導稱，從蛋殼膜中提取DNA 是一種較好的方法，特別是當蛋殼膜上有血管時。隨著非損傷性取樣的研究不斷深入，其樣品形式將不僅包括毛髮、糞便、尿液、脫落羽毛、含口腔脫落細胞的食物殘渣、鱗片以及卵殼等，還會有更多更廣泛的研究樣品。

存在的問題

目前，利用糞便，毛髮等非損傷性取樣進行研究已得到廣泛套用，然而非損傷性取樣的局限性是不容忽視的。利用非損傷性取樣獲取的DNA 含量低，質量不高，並存在著一定程度的降解，而且樣品中常含有影響Taq 酶活性的抑制劑。另外，在DNA 提取過程中或PCR 擴增過程中容易受到外源遺傳物質的污染。所以，能用於基因型分析的DNA 含量是很低的，通常在10-12的數量級。在這種條件下，進行PCR 擴增得到的產物，可能存在兩個問題:(1) 基因丟失(allelic dropout) (2) 假等位基因(false allele)。面對非損傷性取樣存在的各種問題，人們通過改進樣品保存方法及DNA 提取方法等一系列途徑來解決。Roon等利用二氧化矽顆粒乾燥及-20 ℃條件對棕熊(Ursus arctos) 毛髮處理保存，毛髮DNA 降解明顯減緩。Tomoko等利用蛋白酶K 和膠原酶相結合的方法從脫落羽毛和蛇蛻中提取DNA 。實驗證明這種方法比傳統的提取DNA 的方法產量高出約100 倍，而且被提取出的DNA 能用於PCR擴增和其它分析。當樣品中DNA 含量很少且未知的時候，在各種解決方法中，多管法(multiple tubes approach) 是獲取可靠遺傳分析結果的最好途徑之一。這種方法原理是:對每一個選定的遺傳標記位點獨立地進行多次PCR 擴增以提高可信度。理論上進行7 次獨立的操作可信度即可達99 %，實際操作中次數一般大於7 次。但是，多管法耗時且價格昂貴。

研究展望

當前，從提取樣品中DNA 含量和質量以及利用樣品進行後續分析得出結果的可靠性上看，採用非損傷性取樣還不能達到破壞性取樣或非破壞性取樣同樣的效果。然而，非損傷性取樣的套用前景是廣闊的。首先，非損傷性取樣在保護遺傳學、行為生態學、分子糞便學、系統地理學等領域的套用與發展為野生瀕危物種的保護及研究提供了有效的輔助支持。其次，從生物統計學的角度而言，儘可能隨機獲取更多的有效樣本是至關重要的，非損傷性取樣恰恰彌補了傳統取樣法在這方面的不足。最後，目前已有一些輔助的方法，如:建立數學模型，採用計算機模擬實驗或利用可行性評估實驗研究模型來輔助分析，使非損傷性取樣的遺傳分析結果更加可靠。隨著非損傷性取樣的現實意義不斷凸顯，該方法將會得到更深入和廣泛的套用。