《霍亂弧菌二鳥苷酸環化酶VC2370和VCA0956的結構與功能研究》是依託山東大學，由朱德裕擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：霍亂弧菌二鳥苷酸環化酶VC2370和VCA0956的結構與功能研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：朱德裕
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
環鳥苷二磷酸(c-di-GMP)是一種廣泛存在於細菌中的新型第二信使，參與調控細菌的多種重要的生理過程。c-di-GMP的合成和降解分別由二鳥苷酸環化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)完成。其中DGC催化活性由GGDEF結構域決定，PDE由EAL或HD-GYP 結構域決定。基於目前對DGC酶家族結構和功能的研究進展，我們的研究目標主要集中在闡明霍亂弧菌二鳥苷酸環化酶VC2370和VCA0956兩個蛋白的催化機理。擬通過X-射線晶體學方法獲取VC2370和VCA0956兩個蛋白各自在三種狀態下（自由態、結合底物、結合產物）的三維結構，通過結構比較、分析以及定點突變等實驗確定VC2370和VCA0956蛋白的活性位點和別構位點，闡明它們的結構與功能的關係及它們的催化機理，探討c-di-GMP信號通路的調控機制，為揭示細菌豐富而複雜的信號傳導機制奠定基礎。
結題摘要
C-di-GMP信號通路中相關蛋白質的結構與功能研究對於系統地闡明c-di-GMP信號傳導系統具有重要意義。本項目利用生物化學和結構生物學手段，對霍亂弧菌二鳥苷酸環化酶VC2370和VCA0956進行了結構與功能的研究，最終取得了一系列的研究成果。首先我們完成了VC2370和VCA0956重組蛋白的高效表達與純化，然後獲得了apo-VCA0956（169-339）、VCA0956（169-339）-c-di-GMP複合物、VC2370 (399-579)-c-di-GMP複合物等的三套衍射實驗數據，其解析度分別為1.6 Å、2.7 Å和2.8 Å，最後完成了這些晶體的結構解析工作和相關酶活測定分析等實驗。此外，我們還完成了c-di-GMP體外生物酶高效合成的技術和平台。根據結構與功能分析結果，我們提出了一些新觀點： 1. VC2370和VCA0956蛋白的GGDEF結構域前面的結構域對蛋白的高效酶活起著重要的作用，並且也是活性二體化所必需的。 2. 根據VCA0956與c-di-GMP複合物的晶體結果，我們獲得一個很有意思的截短體的突變體，該突變體能自動二聚化，但依然如單體的截短體一樣只有殘留酶活。這說明VCA0956蛋白的高效酶活不僅需要蛋白形成活性中心相連的二體，而且還需這種二體蛋白具有適度緊湊的結構。 3. VCA0956雖然沒有經典的RXXD別構抑制motif，但其酶活依然可以被c-di-GMP抑制，且為競爭性抑制。 4. VC2370含有經典的RXXD別構抑制motif，其酶活可被c-di-GMP非競爭性抑制。 5. 根據VC2370與c-di-GMP複合物的晶體結果，我們設計了一系列突變體，篩選出一個突變體在體外仍保持野生型蛋白的高效酶活，但不再受產物c-di-GMP所抑制。 本項目的研究成果將以研究論文的形式在高水平的國際學術期刊上發表。本項目中的VCA0956的研究結果正在整理成文待投。 另外，本人也參與了“神經退行性疾病相關的重要蛋白Aprataxin同源物Hnt3的晶體結構研究”和“人體先天免疫相關蛋白STING與c-di-GMP的識別機制研究” 等兩項研究，兩篇文章均已發表在國際著名期刊Nature Structural & Molecular Biology上（本人均為並列第一作者）。
