雷帕黴素產生菌基因組尺度代謝網路模型及強化研究

《雷帕黴素產生菌基因組尺度代謝網路模型及強化研究》是依託天津大學，由聞建平擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：雷帕黴素產生菌基因組尺度代謝網路模型及強化研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：聞建平
• 依託單位：天津大學

項目摘要

本申請根據吸水鏈黴菌基因組注釋信息和文獻實驗信息，獲得基因-蛋白-反應的對應關係，並完善反應信息、填加細胞合成反應、填加運輸反應、填補網路缺口和確定維持能，對模型進行修正和調試，使計算結果符合實驗數據，構建出吸水鏈黴菌基因組尺度高質量代謝網路模型；建立模型所有生化反應的代謝通量平衡方程，通過基因組尺度高質量代謝網路定量化分析，在基因組尺度上模擬考察敲除和過表達相關功能基因後對雷帕黴素合成的影響，識別雷帕黴素生物合成的限速步驟、關鍵節點和關鍵途徑，確定目標基因改造；基於確定的目標基因，對吸水鏈黴菌進行定向改造，通過基因操作擴增目標基因以加強限速步驟通量，敲除相關基因減弱支路途徑通量，擴增正調控基因，敲除負調控基因，獲得重新設計的理性基因工程菌，開展發酵技術最佳化研究，獲得具有我國自主智慧財產權的高產雷帕黴素基因工程菌及發酵技術。

結題摘要

本項目依據NCBI和KEGG等資料庫中Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253的基因組等信息，首次成功構建了雷帕黴素生產菌株的基因組尺度代謝網路模型，並聯合代謝通量平衡分析方法和最小代謝調節分析方法對影響雷帕黴素高效合成的關鍵代謝途徑和關鍵代謝酶/酶系進行了模擬及預測，模型預測結果對關鍵基因（gapN）改造後的發酵結果顯示，雷帕黴素產量得到了有效提升。以Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253為出發菌株進行誘變篩選獲得了一株雷帕黴素高產菌株S. hygroscopicus U1-6E7（196 mg/L），並採用代謝輪廓分析方法對該菌株胞內代謝進行分析，發現賴氨酸是影響雷帕黴素高效合成的顯著性因素，賴氨酸外源補料實驗中雷帕黴素產量可達到417 mg/L，與菌株U1-6E7發酵水平相比，提高了112.7%。採用胺基酸代謝輪廓分析法比較原始菌與誘變菌株間胞內胺基酸庫變化的結果顯示，賴氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鳥氨酸等7種胺基酸以及二氫吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和賴氨酸環化脫氨酶等3種關鍵酶對雷帕黴素的高效合成具有顯著影響。在其理性指導下，通過添加不同濃度的賴氨酸進行雷帕黴素的高效發酵最佳化實驗，結果顯示當添加5 g/L賴氨酸時，誘變菌株的雷帕黴素產量達到435.7 mg/L。此外，為了進一步提升雷帕黴素的發酵產量，項目中首次分析了雷帕黴素菌株形態與雷帕黴素產量間的相關性，並通過菌體胞內代謝組學研究策略成功解析出19種潛在的能顯著影響菌體形態和雷帕黴素產量的關鍵代謝物，通過對上述潛在的關鍵代謝物的代謝途徑和菌球形態特徵進行分析，發現溶氧是影響雷帕黴素產量的關鍵因素，通過攪拌轉速和曝氣率等發酵參數最佳化，最終使得雷帕黴素的發酵產量達到536mg/L，較出發菌株雷帕黴素產量約提升了63.9%。