基本介紹
- 中文名：雷射掃描共聚焦顯微鏡
- 外文名：Confocal laser scanning microscope，CLSM
- 簡稱：CLSM
- 領域：光學成像技術手段
- 優點：增強對比度、提高解析度
- 開始發展時間：20世紀80年代中期
背景,雷射共聚焦顯微鏡結構,雷射共聚焦顯微鏡原理,套用,套用功能,套用領域,結語,
背景
雷射掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope）是20世紀80年代中期發展起來並得到廣泛套用的新技術，它是雷射、電子攝像和計算機圖像處理等現代高科技手段滲透，並與傳統的光學顯微鏡結合產生的先進的細胞分子生物學分析儀器，在生物及醫學等領域的套用越來越廣泛，已經成為生物醫學實驗研究的必備工具。
傳統螢光顯微鏡使用螢光物質標誌細胞中的特定結構，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由於許多螢光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了解析度(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的解析度；λ為照明光線的波長；NA 為物鏡的數值孔徑)。但當所觀察的螢光標本稍厚時，傳統螢光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現出來：焦平面以外的螢光結構模糊、發虛。原因是大多數生物學標本是層次區別的重疊結構(如耳蝸基底膜。其實是外毛細胞 、多種支持細胞 、神經纖維等組成的空間結構),，在普通光學顯微鏡下聚焦平面的變化， 會表現出不同的形態。假若螢光標記的結構在不同層次上都有分布，且重疊在一起，反射螢光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來自焦平面上方或下方的散射螢光也被物鏡所接收，螢光顯微鏡的光學解析度就要大大降低 。
在傳統光學顯微鏡基礎上，雷射掃描共聚焦顯微鏡用雷射作為光源，採用共軛聚焦原理和裝置，並利用計算機對所觀察的對象進行數字圖像處理觀察、分析和輸出。 其特點是可以對樣品進行斷層掃描和成像，進行無損傷觀察和分析細胞的三維空間結構[3]。 同時，利用免疫螢光標記和離子螢光標記探針，該技術不僅可觀察固定的細胞、組織切片,還可以對活細胞的結構、分子、離子及生命活動進行實時動態觀察和檢測，在亞細胞水平上觀察諸如 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號及細胞形態的變化，成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等領域中新一代強有力的研究工具，極大地豐富了人們對細胞生命現象的認識。
雷射共聚焦顯微鏡結構
雷射共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用雷射作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的雷射與螢光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描雷射的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。
在結構配置上，雷射掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構造外，還包括雷射光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統 (包括數據採集、處理、轉換、套用軟體)、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統等部分 [2]。由於該儀器具有高解析度、高靈敏度、“光學切片”（Optical sectioning）、三維重建、動態分析等優點，因而為基礎醫學與臨床醫學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對螢光樣品的觀察具有明顯的優勢，只要能用螢光探針進行標記的樣品就可用其觀察。
雷射共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態，也可以用於細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量, 配合焦點穩定系統可以實現長時間活細胞動態觀察。
雷射共聚焦顯微鏡原理
在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。 同時，來自焦點以外的其他區域的螢光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。
雷射共聚焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，採用雷射束作光源，雷射束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，並聚焦於樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發的螢光物質，受到激發後發出的螢光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦後的光被光電倍增管（PMT）探測收集，並將信號輸送到計算機，處理後在計算機顯示器上顯示圖像。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由於照明針孔與探測針孔相對於物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦於照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦[7]。 以雷射作光源並對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為雷射掃描共聚焦顯微鏡。
圖2 雷射掃描共聚焦顯微鏡光路圖
圖2 雷射掃描共聚焦顯微鏡光路圖套用
套用功能
雷射掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代最先進的細胞生物醫學分析儀器之一。它是在螢光顯微鏡成像的基礎上加裝雷射掃描裝置，使用紫外光或可見光雷射螢光探針，利用計算機進行圖像處理，不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結構、分子、離子進行實時動態地觀察和檢測。目前，雷射掃描共聚焦顯微技術已用於細胞形態定位、立體結構重組、動態變化過程等研究，並提供定量螢光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結合其他相關生物技術，在形態學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領域得到廣泛套用。
組織和細胞中的定量螢光測定
雷射掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和螢光染色的標本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦螢光進行數據採集和定量分析,同時還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加， 形成組織或細胞中螢光標記結構的總體圖像,以顯示螢光在形態結構上的精確定位。 常用於原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、單個活細胞水平的 DNA 損傷及修復等定量分析。
細胞間通訊的研究
動物和植物細胞中縫隙連線介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起著重要作用。 雷射掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連線分子的轉移來測量傳遞細胞調控信息的一些離子、小分子物質。 該技術可以用於研究胚胎髮生、生殖發育、神經生物學、腫瘤發生等過程中縫隙連線通訊的基本機制和作用，也可用於鑑別對縫隙連線作用有潛在毒性的化學物質。
細胞物理化學測定
雷射掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長、面積、平均螢光強度及細胞內顆粒數等參數進行自動測定。 能對細胞的溶酶體、線粒體、內質網、細胞骨架、結構性蛋白質、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內特異結構的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。
細胞內鈣離子和 pH 值動態分析
雷射掃描共聚焦顯微鏡技術是測量若干種離子濃度並顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。 利用螢光探針，雷射掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細胞內 pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細胞內的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術檢測細胞內離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而雷射掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像,這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。
三維圖像的重建
傳統的顯微鏡只能形成二維圖像，雷射掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進行圖像疊加可構成樣品的三維結構圖像。 它的優點是可以對樣品的立體結構分析，能十分靈活、直觀地進行形態學觀察,並揭示亞細胞結構的空間關係。
螢光漂白恢復技術
該方法的原理是一個細胞內的螢光分子被雷射漂白或淬滅，失去發光能力，而鄰近未被漂白細胞中的螢光分子可通過縫隙連線擴散到已被漂白的細胞中，螢光可逐漸恢復。 可通過觀察已發生螢光漂白細胞其螢光恢復過程的變化量來分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。
長時程觀察細胞遷移和生長
活細胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養液的適宜溫度及 CO2 濃度的恆定。 目前的雷射掃描共聚焦顯微鏡，其光子產生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結合後可以減小每次掃描時雷射束對細胞的損傷,用於數小時的長時程定時掃描,記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。
套用領域
在細胞及分子生物學基礎研究中的套用
雷射掃描共聚焦顯微鏡套用照明針與檢測孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像並可對標本各層分別成像，對活細胞行無損傷的“光學切片”這種功能也被形象的稱為“顯微 CT”。CLSM 還可以對貼壁的單個細胞或細胞群的胞內、胞外螢光作定位、定性、定量及實時分析，並對胞內成分如線粒體、內質網、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+ 等的分布、含量等進行測定及動態觀察，使細胞結構和功能方面的研究達到分子水平。
在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的套用
普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關抗原進行定性分析，而 CLSM 則可對單標記或者多標記細胞、組織標本及活細胞進行重複性極佳的螢光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結構特徵，抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化。
在血液病學和醫學免疫學研究中的套用
雷射掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細胞和系統，如樹突狀細胞、單核-吞噬細胞系統、自然殺傷細胞、淋巴細胞時，在準確細胞定位的同時有效鑑定免疫細胞的性質。
在大腦和神經科學中的套用
雷射掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發現神經軸突的內部結構連續性好。用雷射掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦幹組織中神經軸突的正常走向，可排除在螢光顯微鏡下由此造成的一些病理假象。並且雷射掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經軸突的三維結構，因此套用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發現的神經組織的細微病變[11]。
在眼科研究中的套用
利用雷射掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網膜、虹膜和睫狀體的結構和病理變化[12]。
在骨科研究領域中的套用
雷射掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領域的套用現狀表明，CLSM在觀測骨細胞形態學研究、骨細胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用具有顯著的優勢。
結語
雷射掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實驗手段和強有力的研究工具，為我們解決一些以往研究工作中不能解決的技術難題創造了條件，因而必將得到更為廣泛的套用。隨著新軟體的不斷開發及各個學科的不斷發展和相互滲透，相信它還將會有更廣闊的發展前景。
