離子凝聚

離子凝聚胺酶聯免疫(EIA)快速二步法檢測HBsAg方法具有可行性。在檢測試驗的第一步反應步驟中加入低離子凝聚胺溶液，設計新的反應條件，對HBsAg進行檢測，並將測定結果與常規二步法和按照試劑盒提供的一步法的測定結果作比較。

新建立的低離子凝聚胺快速二步法檢測B肝標誌物檢出率高，重複性好，符合衛生部對檢測低值量的要求，且操作快速簡便，值得推廣套用。

基本介紹

• 中文名：離子凝聚
• 外文名：Ion condensation
• 描述：快速檢測HBsAg
• 套用：B肝標誌物檢測
• 學科：生物化學

概念

離子凝聚常用於檢測B肝表面抗原。檢測方法有多種，如酶聯免疫測定法(EIA)一步法、二步法、RIA法、電化學發光免疫測定法(ECLIA)等，醫療衛生單位檢測B肝標誌物基本上套用EIA一步法進行定性測定，但該方法影響因素多，結果有時不準確。越來越多的人主張使用EIA二步法，但常規二步法最大的缺點是檢測反應時間長達2h，給日常檢驗工作帶來不便和病人等候時間長而少被套用。本研究是在EIA二步法中加入低離子凝聚胺溶液，旨在縮短反應時間，現將方法及結果報導如下。

材料方法

1、材料

（1）HBsAg質控血清購自衛生部臨床檢驗中心，批號：200403。

（2）EIAHBsAg試劑盒購自上海科華公司。

（3）低離子介質凝聚胺溶液凝聚胺0.5 g、葡萄糖50 g、Na₂EDTA 0.2 g、NaCl 8 g、KCl 2.9 g、KH₂PO₄0.2 g、Na₂HPO₄·2H2O 2.9 g、蒸餾水1000 mL（4℃保存）。

（4）冼滌液枸椽酸三鈉0.588 g加入試劑盒提供的PBS濃液，用蒸餾水稀釋至200 mL。

（5）其他設備伯樂550酶標儀、振盪器、冼板機、水浴箱。

2、方法

（1）試劑盒放置室溫平衡，每孔加入標本量50 μL，每孔加入低離子介質凝聚胺溶液50 μL，室溫（25℃左右）振盪5 min，洗板4次。

（2）每孔加入酶標液2滴，振盪2 min，置37℃，5min，取出冼板5次。

（3）每孔加入顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，封板。置37℃，15min，每孔加終止液1滴，混勻，用酶標儀讀數，波長450 nm，10 min內完成。

研究分析

結果

最低檢測量以樣品吸光度值Cut/Off值（S/CO值）≥1判定為陽性，各質控品S/CO值見表1。表1可見，本方法最低檢測量1ng/mL，符合衛生部有關最低檢測量的要求。

表1 HBsAg各參考品S/CO值表

討論

凝聚胺介質溶液廣泛用於血庫交叉配血和血型鑑定，近來有報導用於肥達氏試驗等方面抗原抗體測定，我們嘗試用於B型肝炎表面抗原測定，取得快速、特異的良好效果。血清學實驗是抗原與抗體結合形成複合物的反應過程，凝聚胺是低離子聚合物，在水溶液中帶強大的正電荷，能使抗原抗體之間的引力增加，距離縮短，增加有效碰撞，同時可解除抗原抗體複合物周圍的電荷和水化膜，促進抗原抗體複合物的形成，極大地加速反應速度，縮短了結合反應時間。凝聚胺低離子介質聚合物可以形成非特異性抗原抗體反應，但我們在洗液PBS中加檸檬酸鈉配成的洗液進行洗滌，可以消除這種現象，360份陽性標本測定結果與常規二步法測定結果比較完全一致。反應過程中，除低離子介質凝聚胺溶液外，電解質對抗原抗體完全結合亦相當重要，所以我們在試劑配製中加入了電解質和緩衝對物質。此外，充分振盪對增加抗原抗體之間的有效碰撞，加速抗原抗體複合物形成亦非常關鍵。

較多認為EIA二步法是測定B肝表面抗原準確可靠的方法，陶洪群比較了ECLIA法和EIA一步法、二步法檢測HBsAg結果，認為ECLIA法靈敏度高，自動化程度高，省時；EIA一步法受鉤狀效應影響明顯，漏檢率高；EIA二步法能較好避免鉤狀效應，敏感度高，漏檢率低，但費時。單桂秋等對EIA一步法和二步法進行了分析，也認為EIA二步法結果可以消除一步法的前帶鉤狀效應。雖然ECLIA一步法檢測HBsAg優越，但設備試劑昂貴，收費高，加重病人的負擔，一直來未能在醫院特別是廣大的基層醫院廣泛套用。而EIA一步法由於無需貴重儀器設備，且試劑價格便宜，操作簡便快速被廣泛套用於臨床診斷，但其結果的準確性受到一定程度的影響；EIA二步法檢測結果的準確可靠性已被公認，但其檢測反應的時間長，不能充分滿足臨床和患者的需求而較少地推廣使用。我們研究的低離子介質凝聚胺快速EIA二步法，反應過程僅需10min，經與常規EIA二步法對360份HbsAg陽性結果進行測定比較，結果與常規EIA二步法檢測結果符合率一致，未見有前帶和鉤狀效應的影響，消除了常規EIA二步法反應時間過長的因素，整個試驗無需特殊設備，試劑配製簡單，操作簡便，易於掌握，特異性強，最低檢測量符合衛生部的要求，值得推廣套用。

DNA平衡離子凝聚的動態光散射分析

DNA作為一種生物大分子，與中性高分子和簡單電解質相比，它是一種有著不同特性的聚電解質。當溶解於極性溶劑時，DNA將離解成高帶電量的聚離子，且周圍布滿了許多小的平衡離子。由於DNA附近不同化合價的平衡離子分布不均勻，導致DNA的長程靜電相互作用和熵發生變化，從而改變DNA的構型。

通常人們利用平衡離子凝聚理論，蒙特卡洛模擬或者通過解泊松-玻爾茲曼方程來研究聚電解質周圍的平衡離子分布，這些理論研究結果表明平衡離子在聚電解質表面凝聚形成一種薄層結構。其中Manning的平衡離子凝聚理論通常用於描述在溶液中小離子與聚電解質的非特異性結合。強帶電的線性聚電解質將吸附它周圍的平衡離子，吸附的平衡離子中和了聚電解質上的電荷。

DNA是遺傳信息的載體，細胞中的DNA必須凝聚成特定結構裝載到細胞核中。因此，DNA凝聚在人工基因轉移與轉染過程、基因治療和基因重組等方面有潛在的套用。從Manning的平衡離子凝聚理論可知，平衡離子能中和DNA上的大部分電荷，但DNA上還有部分未被中和的電荷，DNA分子之間還存在著靜電排斥力。如何克服這個剩餘靜電排斥力，Shklovskii研究小組提出了一種新的理論解釋。他們認為，由於強的橫向排斥效應，平衡離子在DNA表面形成了一種類似Wigner晶體結構的強關聯流體結構。吸附在DNA表面的平衡離子禁止了DNA的電荷，從而使得DNA間的排斥力減小，當DNA之間的靜電排斥力小於靜電吸引力時，DNA發生凝聚。多價平衡離子在DNA表面形成的強關聯流體結構使得平衡離子的結合能大於kBT，這導致了更多的平衡離子吸附在DNA表面。當多價平衡離子的濃度達到一個臨界值時，吸附在DNA表面的平衡離子的總電荷在絕對值上將大於DNA的電荷，使得DNA的淨電荷的符號發生了反轉，這種現象就叫做DNA的電荷反轉。

單價和二價平衡離子與DNA的相互作用

DNA可看成一種線性的強帶電的聚電解質，且每個磷酸根基團都帶有一個單位的負電荷，當溶於極性溶劑中，平衡離子將在DNA周圍凝聚成一個薄層。根據Stern(斯特恩)模型，這個薄層應該分成兩個部分：第一部分包括吸附在表面的一層離子，形成了一個內部緊密的雙電層，稱為Stern層；第二部分為Gouy-Chapman擴散層。按照Stern模型，DNA分子在運動時，應該與Stern層不可分離，似乎切動面就是Stern面。但是由於固體表面吸附的離子仍然保持者溶劑化(至少在擴散層的一側)，故DNA分子運動除了與吸附的平衡離子一起外，還會帶著一薄層溶劑化的液體，因此實際運動的切動面應該在Stern面的更右側一點，這個切動面上的電勢就稱為ζ(Zeta)電勢或動電勢。

圖1 DNA的Zeta電位分布圖

利用DLS技術分別測量了在緩衝液中只包含平衡離子Na⁺或Mg²⁺的情況下DNA的電泳遷移率隨平衡離子濃度的變化，如圖1所示。從圖1中可以發現當平衡離子的濃度c<5 mM時，DNA的電泳遷移率隨著平衡離子濃度的增大而逐漸減小，且平衡離子的化合價越大，DNA的電泳遷移率減小得越快。當c>5 mM時，DNA的電泳遷移率逐漸趨於穩定，且DNA分子的電泳遷移率µ₁:µ₂≈2:1，即緩衝液中只包含Na⁺或Mg²⁺時的電泳遷移率之比約為2:1，實驗所得結果與Manning的理論值相符合。對於單價或者低濃度的二價的平衡離子，它們只是中和DNA雙螺旋結構上的磷酸根基團所帶的負電荷，而無法使DNA發生凝聚。通過AFM實驗觀察到，在低濃度的二價平衡離子的條件下DNA在溶液中是以自由舒展的形態存在，如圖2(a) 所示。正是由於低濃度的二價離子無法導致DNA凝聚，所以二價平衡離子常用於DNA分子的AFM成像。

圖2 (a)MgCl2成像DNA的AFM圖像；(b)[Co(NH3)6]3+導致DNA凝聚

三價平衡離子與DNA的相互作用

多價陽離子能導致DNA的形態發生變化。由於DNA雙螺旋結構上帶負電荷的磷酸根基團之間的靜電排斥作用，DNA在溶液中是以自由舒展的形式存在。而這些多價陽離子能中和DNA雙螺旋結構上的磷酸根基團所帶的負電荷，從而使磷酸根基團間的靜電排斥力減小，導致DNA的形態發生改變。當多價陽離子的濃度大於臨界值時，DNA分子將凝聚成特定的緊密結構。本文通過DLS實驗研究了DNA的電泳遷移率與三價平衡離子[Co(NH₃)₆]³⁺濃度的變化關係。

當DNA溶液中加入三價離子，這些三價離子結合在磷酸根基團和氮基位點上使得DNA上的負電荷大部分被中和。通過觀察AFM圖像，可知[Co(NH₃)₆]³⁺可使DNA分子發生凝聚，凝聚結構為花狀結構，如圖2(b)所示。根據文獻可知，當平衡離子的化合價Z>3時，DNA發生凝聚，這表明多價離子的化合價越高，越容易使DNA發生凝聚。在溶液中多價離子導致DNA凝聚，此時的DNA電泳遷移率不僅與DNA上的有效電荷有關，而且可能與DNA的結構有關。由於在理論上我們假設DNA的遷移率只與它的有效電荷有關，而不考慮DNA的結構的變化，所以我們得出的實驗結果與理論數據有明顯偏離。

研究結論

系統地研究了不同化合價的平衡離子與DNA之間的相互作用。動態光散射的實驗結果表明當溶液中只存在單價平衡離子或者二價平衡離子時，其實驗結果與Manning的平衡離子凝聚理論結果相符合。當溶液中的平衡離子的化合價Z>3時，DNA發生凝聚，此時DNA的電泳遷移率不僅與DNA上的有效電荷有關，還可能與DNA的結構有關，所以測得的實驗結果大於理論值。當平衡離子的化合價Z=4時，DNA的電荷發生反轉，這主要是由於吸附在DNA表面的多價離子的總電荷大於裸DNA的電荷的絕對值。因此，對於一般情形，自由溶液中的聚電解質的構型和離子關聯效應與聚電解質遷移過程密切相關。