《降低慢病毒載體轉錄“通讀率”的研究》是依託上海交通大學，由張敬之擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：降低慢病毒載體轉錄“通讀率”的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張敬之
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
慢病毒載體是目前基因轉導和基因治療的重要工具。但是以刪除U3啟動子為標誌的第三代慢病毒載體卻因此刪除而造成其轉錄本在3'不能被完全終止而通讀，由此可能激活下游原癌基因等而導致安全隱患。雖然科學家們已通過插入隔離子等方法來降低轉錄通讀率，但仍未能完全消除轉錄通讀。因此深入開展提高慢病毒載體的安全性的研究具有重要的意義。我們先前在慢病毒載體整合入染色體後，在保留它所攜帶的外源基因的同時，刪除了其大部分的病毒元件，使之幾乎不可能形成重組相適應性慢病毒。在此基礎上，本課題擬進一步通過疊加已被證實有效降低轉錄通讀率的不同類型的元件，或引進多個轉錄終止信號R,或篩選新的小分子隔離子，以及組合上述研究結果，在不顯著降低假病毒滴度的前提下，進一步降低慢病毒載體的轉錄通讀率，並與我們已取得的在慢病毒載體引進自刪除的研究成果相結合，力爭使我們的慢病毒載體能夠基本達到臨床使用的要求。
結題摘要
隨著精準醫療、幹細胞技術以及基因治療載體技術的快速發展，這幾年，基因治療又被重新提到了一個越來越重要的位置上。而慢病毒載體在其中扮演著一個重要的角色。 本項目的研究目的是在第三代慢病毒載體的基礎上，通過對載體的改造，來改善其由於大部分的U3區被刪減，而造成的上游轉錄本在3'不能被完全終止，進而轉錄通讀至整合位點的下游。此一現象的發生，有可能造成激活下游原癌基因等而產生安全隱患。 通過設計10套最佳化慢病毒載體轉錄通讀率的方案（附屬檔案1）。我們在三個層面（pEGFP-N1報告基因載體系統、FUGW轉移載體系統和模擬原病毒載體系統）（附屬檔案1），分別在RNA和蛋白兩個水平上檢測了的轉錄通讀率（附屬檔案1，附屬檔案2，附屬檔案3）。最終篩選出三種原創的，優於已報導的有效改善轉錄通讀的方案（附屬檔案1，附屬檔案4）。F、C-U、和2.4C-這三種元件在插入慢病毒載體後，我們觀察到了其有效降低轉錄通讀率，達到幾乎為零的程度，優於野生型的HIV-1的轉錄通讀率（附屬檔案4）。在此基礎上，我們研究了這些元件的插入，對慢病毒載體的顆粒數以及整合率等生物特性的影響。我們發現它們對產病毒的顆粒數影響不大（附屬檔案5）。另外，將泡沫病毒嵌合體LTR的載體，F慢病毒載體感染293T細胞後，我們檢測了其整合在染色體上的LTR的完整性。並且發現大約十分之一的F病毒整合在染色體上的LTR是不完整的（附屬檔案6）。因此，我們針對F病毒的LTR的完整性進行了最佳化篩選。經最佳化後的F病毒載體，在染色體上，沒有發現有不完整的LTR產生（附屬檔案7）。與未最佳化的F病毒相比，最佳化的F病毒載體的轉錄通讀率和生物滴度基本相似（附屬檔案6）。至此，我們成功地構建了轉錄通讀率幾乎為零的、在染色體具有完整的LTR的、更加安全的慢病毒載體。這載體保留了其能夠在非分裂細胞（如：小鼠神經原細胞）的有效感染和表達的能力（附屬檔案8）。此項研究成果，被用於申請了專利（附屬檔案11，12）。我們的慢病毒載體安全性改進的研究成果，使之能夠進一步滿足臨床基因和細胞治療的安全要求。同時，也使我們圓滿地完成了本課題的研究任務。
