《安全性慢病毒載體介導的β-地中海貧血基因治療研究》是依託上海交通大學，由張敬之擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：安全性慢病毒載體介導的β-地中海貧血基因治療研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張敬之
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
β地中海貧血（β-地貧）是常見的遺傳性血液病，也是基因治療的最佳候選疾病之一，而慢病毒載體（LVV）則是基因治療中被運用最多的載體之一。近年來，以LVV介導的對β-地貧的基因治療雖然取得了效果，但同時也引發了細胞的克隆化擴增現象，從而存在著潛在的安全性隱患。因此，如何組織實施既安全又有效的β-地貧基因治療的方案是該研究成功與否的關鍵。本課題擬將近年來我們在改進LVV的安全性研究方面所取得的科研成果，即在LVV整合入染色體後，進一步自刪除其慢病毒元件，以及降低LVV轉錄通讀率的科研成果，與本所多年來在β-地貧基因治療研究的成功經驗相結合，用經安全性改進的LVV介導β-珠蛋白基因等在β-地貧的細胞和模型小鼠中進行基因治療的研究。從外源基因的表達、貧血症狀的改善程度以及載體的位點整合信息等多方位、多角度地進行安全性和有效性的深入評估，從而為β-地貧基因治療的臨床套用提供理論和套用依據。
結題摘要
本研究的目的，是基於我們小組前期改善慢病毒載體（LVV）安全性的研究成果的基礎上，針對LVV在基因與細胞治療中所存在的安全隱患，打造在紅系更充分表達β-珠蛋白基因，更安全的，國際領先的LVV。首先，我們對各降低LVV的轉錄通讀元件進行了系統的研究。我們共設計了10套有可能降低轉錄通讀的元件組合，通過一系列的研究，在各細胞系，分別使用各種不同的載體系統，即模擬pro-LVV在染色體上的質粒系統或轉導LVV病毒後經整合入染色體以後，在RNA和蛋白水平各個不同的層面上分別檢測其轉錄通讀率。我們最終篩選出2種原創的、最有效降低LVV轉錄通讀的方案，即C-U和F。本項目作為第一資助項目，將本研究成果及其生化特徵已被發表在2019年5月的The Journal of Gene Medicine雜誌上。在此基礎上，我們還融合了以上兩個研究成果，構建了自刪除、低通讀率的紅系特異表達β-珠蛋白基因的LVV。並且以β-地貧模型小鼠作為受體小鼠，製備了轉基因小鼠。我們認為β-地貧基因治療的成功與否的關鍵之一，是需要有既紅系特異地高效表達，又安全可靠的表達載體的支撐。為此我們重新構建了BB305作為對照載體。在驗證和比較該載體過程中，我們認為我們有必要並且也有能力打造比BB305更加安全有效的LVV。為此，我們首先設計了各種組合的嵌合體啟動子，來驅動置於β-珠蛋白基因座內的GFP基因的表達。經轉染K562等細胞以後，通過流式細胞術篩選出了最強表達GFP的啟動子組合。將此質粒進一步轉染入小鼠胎肝細胞以後，經Ter119抗體標記後，用磁珠法分離該群體細胞。通過流式細胞術檢測，並且與Ter119抗體標記陰性細胞相比較，證實了該啟動子與β-珠蛋白基因啟動子具有相似的紅系特異性。至此，我們初步獲得了表達強度高於BB305的嵌合體紅系特異表達的強啟動子。與此同時，我們還在K562等細胞檢測了BB305的轉錄通讀率。當我們在其下游插入由我們研發的降低轉錄通讀的元件C-U時，則其轉錄通讀率得到了有效的降低。相關研究成果正打算被用於申請新的國家自然科學基金項目的研究基礎。至此，在本項目的研究中，我們取得了以下的的研究成果：（1）完整地描述了2個原創的更加有效地降低LVV轉錄通讀的元件及其相關的生理特徵。（2）初步打造了比BB305更加安全有效的，國際領先的LVV。
