《阿特拉津脫氯酶分子定向進化的研究》是依託南開大學，由陳德富擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：阿特拉津脫氯酶分子定向進化的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳德富
- 依託單位：南開大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
阿特拉津是世界範圍內廣泛使用了50多年的廉價除草劑。2-位上因攜帶氯原子使其變成農業和人居環境污染物。其環境污染已被聯合國環境暑列為當前急需解決的實際問題。植物修復儘管是環境修復重要方向，但現有基因的修復效果遠不及人們預期。因此，國外有人通過定向進化試圖最佳化其特性，但實驗設計及篩選通量的不足，其進化效果並不理想，策略上需要改進。在前期實驗中，我們發現雨生紅球藻對阿特拉津異常敏感，是阿特拉津脫氯酶突變子理想的超高通量篩選平台。基於此發現，本項目擬通過雨生紅球藻lcyB定點插入+選擇壓力提高超高通量方法對突變文庫進行大規模篩選，以獲取酶活性提高10倍以上的超級基因，再通過酶功能分析、生物信息學和酶動力學分析闡明其功能域和酶學機制，為套用轉基因植物高效修復阿特拉津污染環境、為套用阿特拉津機械化生產高純度雜交稻種子、為開發廉價植物轉基因標記系統提供酶學基礎和理想的、具有智慧財產權的抗性基因。
結題摘要
阿特拉津氯水解酶近幾年已經引起了越來越多人們的關注，因為它能將有毒的阿特拉津轉變為無毒的羥基阿特拉津。由於它自身的這種優勢，所以可用來降解環境中有毒的阿特拉津。正是看中這種特質，本研究對阿特拉津氯水解酶進行了定向進化，以期望得到酶活力提高的突變子，從而為環境中阿特拉津的生物降解提供試驗材料。但是，阿特拉津氯水解酶在大腸桿菌中以包涵體的形式存在，這大大限制了大腸桿菌在篩選體系中的作用。為了克服這種障礙，本研究利用一種基於雨生紅球藻的高通量篩選方法，在隨機突變文庫中成功獲得了大量耐高濃度(1.0 μg/mL)阿特拉津的突變株，該突變株耐阿特拉津的濃度提高了10倍(野生型最大耐受能力是0.1 μg/mL)。對它們進行克隆、表達、復性，測定了酶比活力及動力學參數的測定。它們的比活力提高顯著，是野生型的2.7到5.0倍，而且催化效率(kcat/Km)也提高至野生型的2.5至4.1倍。序列分析顯示，酶活力提高最明顯的兩個突變體(10-7、21-1)為單胺基酸替換突變子，這表明其替換位點Val12或Leu395對酶功能的發揮有重要作用。共同擁有四個相同胺基酸替換的突變子(48-6、32-2、7-10)的獲得也表明這四個胺基酸位點(M315、H399、N429、V466)也是十分重要的。通過對以6個同源蛋白為模板建立的三維模型的分析及配體位置及結合位點的預測，發現AtzA具有氨基水解酶家族典型的(β/α)8結構域及一個雙β-sheet結構域。本研究確定了鐵離子的空間位置及與之結合的五個胺基酸位點，指出與配體及底物結合的位點位於(β/α)8結構域中由8個β-strand組成的桶狀核心內。此外，本研究通過分析突變位點的三維結構分布，認為臨近(β/α)8結構域的β-sheet內的突變顯著影響酶活性，這種影響可能是由於其整體結構穩定性的改變所致。本項目還開展了atzA轉植物研究、作為遺傳標記基因的微藻轉基因體系研究、外源基因表達的包涵體消融機理研究及AtzA關鍵位點的點飽和突變研究。項目實施過程中，共培養碩士生6名、博士生4名，發表論文6篇，另有1篇論文正在投稿、1篇論文正在整理，超額完成了預期考核指標。
