重組hMsrA穿膜活性蛋白對血管內皮功能的調節研究

《重組hMsrA穿膜活性蛋白對血管內皮功能的調節研究》是依託武漢大學，由杜芬擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：重組hMsrA穿膜活性蛋白對血管內皮功能的調節研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：杜芬
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

血管壁氧化應激與動脈粥樣硬化(As)的發生髮展密切相關。氧化易使蛋白質中甲硫氨酸轉為甲硫氨酸亞碸(MetO)，而細胞記憶體在的MetO還原酶A (MsrA)能特異催化MetO還原，成為細胞內一道特殊的抗蛋白氧化損傷的防禦屏障。我們前期通過原核表達體系獲得純化的人MsrA（hMsrA），證實其能在細胞外直接修復氧化的脂蛋白並抑制氧化脂蛋白引起的內皮細胞凋亡，但外源MsrA難以直接進入細胞內成為限制其調節血管壁細胞抗氧化功能的關鍵環節。本課題擬藉助新型高效運載體- - 細胞穿膜肽，構建pep-1-hMsrA重組蛋白，檢測重組hMsrA進入血管內皮細胞的效率和調節細胞抗氧化的能力；進一步利用apoE基因敲除鼠，靜脈輸入pep-1-hMsrA，研究其對血管壁局部及整體氧還狀態的調控及As斑塊形成的干預作用，為開發防治As所致的冠心病、中風等心腦血管疾病的抗氧化生物技術藥物提供新思路和技術策略。

結題摘要

提高機體組織細胞抗氧化能力的有效途徑，對於動脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)所致的冠心病、中風等重大心腦血管疾病的防治具有重要意義。本項目著重探討細胞中特殊的抗氧化系統甲硫氨酸亞碸還原酶A (Methionine sulfoxide reductase A, MsrA)的調節功能，並利用新型高效運載體——細胞穿膜肽pep1將hMsrA導入細胞，嘗試安全的、能特異增強細胞抗氧化防禦能力、調控血管壁氧還狀態的可行策略。本課題首先利用pET28a載體構建pET28a/pep-1-hMsrA和pET28a/hMsrA的原核表達系統，經誘導表達、親和層析分別獲得純化的pep1-hMsrA與hMsrA蛋白，通過特異酶活性及CD光譜法鑑定，兩者二級結構相似，活性無明顯差異，說明pep1與hMsrA的融合蛋白對hMsrA的結構和功能活性無顯著影響，同時，多種細胞水平實驗證實了pep1-hMsrA蛋白的跨膜轉導活性及細胞內的生物半衰期，並發現在ox-LDL處理的小鼠腹腔巨噬細胞中， pep1-hMsrA比hMsrA發揮更強的保護細胞作用。此外，進一步以apoE-/-小鼠為動物模型，可觀察到靜脈注射pep1-hMsrA較hMsrA發揮有效地抑制As進程的作用，在小鼠心臟組織中也檢測到高量的pep1-hMsrA，在動物水平進一步證實了pep1-hMsrA的細胞膜穿透能力；比較小鼠主動脈斑塊形成情況，顯示pep1-hMsrA組注射小鼠的As形成略有減少，尤其在胸主動脈和腹主動脈部分差異有統計學意義。由以上結果我們認為hMsrA具有細胞抗氧化保護作用，與細胞穿膜肽pep1融合後的蛋白pep1-hMsrA能進入細胞內更好的發揮抗氧化保護作用，從而更為有效的抑制As的發生髮展。