適配體

核酸適配體是一小段經體外篩選得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能與相應的配體進行高親和力和強特異性的結合，它的出現為化學生物學界和生物醫學界提供了一種新的高效快速識別的研究平台，並在許多方面展示了良好的套用前景。

基本介紹

• 中文名：適配體
• 全名：核酸適配體
• 成份：寡核苷酸序列
• 特性：高親和力和強特異性
• 行業：化學生物學界和生物醫學界
• 作用：核酸適配體的化學修飾方法
• 作用：分析化學和酶化學中套用

核酸適配體簡介

SELEX 技術是20世紀90年代初新興並發展的一種體外指數富集配體的系統進化的組合化學技術，能夠有效地用於核酸結構分析與功能研究。核酸適配體(aptamer)是基於SELEX 技術從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得的對靶物質具有很高特異性與親和力的寡核苷酸序列。人工化學合成一個文庫容量為1014-1015的隨機寡核苷酸文庫，其總長度一般為70-100 nt，中間包含20-40 nt的隨機序列。文庫與靶標物質孵育一定時間後形成核酸-靶標的複合物，利用一定的方法除去未與靶標結合的文庫序列，複合物熱解離獲得與靶標結合的序列，並以此為模板進行 PCR 擴增，進而製備下一級文庫。經過8-20輪不斷篩選獲得對靶標具有高特異性與高親和力的寡核苷酸序列，即適配體。適配體經克隆測序後獲得相應核酸序列用於後續的研究

適配體的篩選方法

適配體靶標範圍廣，靶標的大小與可溶性均不同，因此套用 SELEX 技術篩選核酸適配體可以採用不同的具體操作方法。離心沉澱法常用於針對細胞、細菌與病毒的適配體篩選，固相吸附與洗脫技術可以用於可溶性小分子的適配體篩選。適配體篩選的具體方法包括以下幾個方面。

基於不同固定介質的篩選方法。硝酸纖維素膜過濾法是一種常用於蛋白質適配體篩選的方法。Joshi 等基於硝酸纖維素膜設計了一種橫向流動色譜裝置，結合套用該裝置與 SELEX 篩選技術，作者經過7輪正篩和3輪反篩獲得了針對鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白(Omp)的高親和力適配體33和45序列，檢出限為10-40 cfu/mL。凝膠柱亦是適配體篩選常見的固定介質。Tang等基於瓊脂糖凝膠樹脂套用SELEX 技術篩選獲得對紅豆毒素具有高特異性與高親和力的適配體，其解離常數低至幾nmoL範圍。近些年來，以微孔板為固定介質篩選適配體套用廣泛。王立峰等基於微孔板技術篩選獲得能與癌胚抗原(CEA)特異性結合的高親和力適配體序列，研究表明該適配體在腫瘤早期診斷、監測與治療方面具有重要作用。

螢光磁珠 SELEX(FluMag-SELEX)技術。FluMag-SELEX 是結合套用磁珠與 SELEX技術篩選螢光適配體的一種方法，該方法需要靶標量少且可通過螢光直觀測定結合適配體的量。Kim 等套用FluMag-SELEX 技術篩選獲得廣譜抗炎性藥物布洛芬的5條特異性適配體。其中三條是外消旋布洛芬的特異性適配體，另外兩條能與外消旋和內消旋布洛芬特異性作用。布洛芬適配體的特異性強，與布洛芬類似物、土黴素均沒有結合作用。Xu等套用 FluMag-SELEX 技術篩選獲得多氯聯苯的特異性適配體，其解離常數為微摩爾級別，且在 0.1 到 100 ng/mL 範圍內線性良好。

毛細管電泳SELEX 技術(CE-SELEX)。不同組分間的荷質比存在一定差異，導致物質的電泳遷移率有所不同，從而實現不同組分的分離。CE-SELEX 能在2-4輪內實現高親和力適配體的篩選，常被用於篩選蛋白質、脂多糖、多肽等大分子物質。Yang等首次利用 CE-SELEX 實現了對小分子物質甲基嗎啉的適配體的篩選，經過3輪篩選後獲得了8條高親和力適配體，其解離常數為到幾百nM 到幾uM，其中兩條序列能夠催化中卟啉的金屬插入反應，催化強度分別為1.7倍和2倍。針對親和力較弱的適配體與靶標體系存在動態解離平衡這一問題，科研工作者發展了平衡混合物的非平衡毛細管電泳(NECEEM)、平衡混合物的平衡毛細管電泳(ECEEM)和 Non-SELEX 毛細管電泳技術。Ashley 等套用 Non-SELEX 技術篩選獲得過氧化氫酶的適配體，作者套用螢光分光廣度計與毛細管親和力電泳表征了其親和力與特異性，結果顯示適配體對靶標的親和力比與其他四種蛋白的親和力高至100倍，也顯示了其高特異性。該適配體可套用於生物感測器、免疫印跡與生物標誌物鑑定。Ashley 等又基於 NECEEM 和 SELEX 技術篩選獲得在自由的三維空間環境的人類瘦素蛋白的適配體，其解離常數為幾百 nM。

細胞 SELEX(Cell-SELEX)技術。該方法的主要靶標物質是細胞、細菌或病毒等，操作過程中採用離心、沉澱的方法分離去除未結合適配體，再通過熱解離或酶切作用獲得特異性適配體序列。Liang 等針對感染狂犬病毒的活細胞，套用 Cell-SELEX 經過35 輪重複篩選獲得了 5 條 DNA 適配體。病毒效價測定與實時定量反轉錄 PCR 實驗均表明篩選獲得的 5 條適配體能夠抑制狂犬病病毒的複製，為狂犬病感染的治療提供了一種可能性。Ninomiya等套用 Cell-SELEX 經過 11 輪重複篩選，獲得12條與人類肝癌細胞HepG2 特異性結合的高親和力適配體，其解離常數範圍為19-450 nM。作者分析獲得 12 條適配體共有的二級結構，這與 HepG2識別密切相關。該方法可以在靶標性質不明確、結合位點未確定的情況下進行篩選，並且無需製備靶標的複雜過程。

適配體的優點

自20世紀90 年代適配體的概念被提出以來，科研工作者不斷致力於適配體的研究，發現適配體具有許多優點。首先，相比較傳統微生物培養，檢測周期短、檢測限低且具有高親和力與強特異性，這源於適配體具有較大表面積和大量受體結合位點且空間三維構型易形成螺旋、發卡、莖環、凸環、三葉草和假結等結構，能夠與靶標物質基於范德華力、氫鍵和疏水作用等緊密結合，並可以區分結構類似物質；其次，相比較抗體檢測，篩選獲得的適配體易於體外大量合成，重複性好、穩定性高且易於貯存；再次，相比較分子生物學，操作簡便易行，檢測成本較低；同時，適配體靶標廣泛，包括農藥、組織、細胞、病毒、蛋白質、毒素、維生素和過敏原等；適配體易於標記螢光且活性不受影響，因此易於結合套用其他檢測技術。

適配體的套用

1990 年，Tuerk與Ellingtong基於 SELEX 技術率先分別篩選獲得了噬菌體T4DNA聚合酶與有機染料的特異性RNA適配體。自此以來，適配體已經被廣泛套用於細胞成像、新藥研發、疾病治療與微生物檢測等眾多方面。

細胞成像：螢光標記適配體或適配體複合物是適配體套用於細胞成像的基礎。流式細胞儀、螢光分光光度計常被用於測定螢光標記適配體與靶細胞結合力的大小，螢光顯微鏡能夠呈現複合物的直觀圖像。Wang 等基於FISH技術和螢光標記的特異性DNA 適配體構建了綠膿假單胞菌的成像檢測系統。螢光適配體探針還可以用於細胞內部的顯微成像。Valencia 等基於核糖核酸結合蛋白質及其適配體間的相互作用，實現了大腸桿菌活細胞內細菌 RNA 的成像工作。

藥物傳送：科研工作者已經研發了多種抗癌藥物，納米材料也廣泛套用於藥物的傳送，但其具有生物相容性差、不能定向傳送且對其他細胞傷害大的缺點。適配體能夠與靶標特異性結合，納米材料-特異性適配體複合物能夠實現藥物在細胞內的定向傳遞。Chang 等構建了一種五角星構型的納米材料二十面體，其與特異性適配體 DNA 結合後可以攜載阿黴素，定向傳送到病灶位置，特異性導致上皮癌細胞死亡。J

疾病治療：研究發現 MCF7 附膜抗原蛋白的特異性適配體能夠通過生物素-鏈霉親和素反應與補體組分1(C1q)結合，顯著誘導癌細胞膜的滲透壓膨脹甚至細胞死亡，對於乳癌的治療具有一定作用。適配體的動力學性質與促凋零作用表明 GSH-RNA 適配體是一種潛在的抗癌化學治療劑。

微生物檢測：食源性致病菌的檢測是科學工作者研究的重要課題，目前適配體已經廣泛地套用於致病菌的檢測。Joshi等套用 SELEX 技術，篩選獲得了鼠傷寒沙門氏菌的兩條適配體，其檢測下限可達10-40 cfu/g，實現了環境與食品中鼠傷寒沙門氏菌的快速靈敏檢測。