基本介紹
- 中文名：透析平衡結晶法
- 外文名：Dialysis method
定義,特點,技術改進,影響因素,溫度,樣品純度和均一性,沉澱劑,pH值,電場,套用,
定義
透析平衡結晶法，亦稱膜結晶法，是用半透膜隔開蛋白質溶液和結晶劑，通過膜蒸餾逐漸脫去蛋白質溶液中的溶劑分子，使得蛋白結晶溶液濃度緩慢升高達到亞穩區狀態，從而產生蛋白質結晶的技術。常用的透析設備有透析管和微量透析紐扣。
特點
與常規結晶技術相比，膜結晶技術具有結晶速度快、起始濃度低、誘導時間短、過程可控等優點，且可以更好地、更方便地控制晶體結晶過程，得到質量更好的晶體。此外，膜表面還可以起到非均相成核的作用。膜結晶過程的多功能性，使研究者可以在較短誘導時間內得到質量完美的生物大分子晶體。可以預言，膜結晶作為一種新興的結晶分離技術，在蛋白質的結晶方面擁有較好的潛力和較大的套用前景。
但是，透析結晶限制了諸如聚乙二醇（PEG）等結晶劑的使用，因為PEG吸出透析袋內水分的速度遠大於其滲入膜的速度，從而導致袋內蛋白質產生沉澱。
技術改進
普遍認為膜蛋白很難在水性環境中保持活性，而平衡透析法可以為膜蛋白質的結晶提供一個疏水的環境來維持其活性，因此平衡透析技術被廣泛套用於膜蛋白質的結晶。有研究者提出選擇脂質立體中間相做介質來提高膜蛋白質的可結晶性。但是這種膜粘性較強，不易操作。
為解決上述問題，發明了一種膜引，是一種由清潔劑和脂質形成的雙分子層，這種膜在溫度低的時候處於液體狀態；而當溫度升高的時候，膜就變為粘性比較強的膠狀固體。膜不僅可以為蛋白質提供疏水環境，而且從雙分子層中收穫晶體也變得簡單易行。但是膜蛋白因為存在表達量比較低和容易形成聚集體等問題，目前其對晶體的研究尚處於起步階段，有待發展更先進的技術來提高篩選成功率。
另一種微透析方法，將蛋白質溶液注射到一個毛細管中，毛細管覆有透析膜，膜可用塑膠管套緊。對蛋白質溶液進行簡單離心，然後用鑄模粘土將毛細管封閉，接著將毛細管放入含有透析液的管中。
影響因素
影響蛋白質結晶的因素大致可分為物理因素、化學因素以及生物化學因素等。物理因素包括溫度、電磁場和壓力等外界條件；化學因素包括溶液濃度、pH值、過飽和度以及離子強度等溶液環境；生物化學因素包括蛋白質結構、對稱性、均一性以及等電點等。
溫度
溫度能夠通過改變蛋白質的溶解度影響結晶過程。蛋白質在高溫下的溶解度隨結晶過程是由焓驅動或熵驅動決定。溫度能夠影響蛋白質側鏈的酸鹼平衡常數，胺基酸殘基側鏈電離基團的pKa與介質的離子強度關係非常密切。蛋白質在低離子強度介質中溶解度隨溫度升高而升高，在高離子強度時則降低。溫度因素一般用於篩選最佳化結晶條件和生長高質量晶體。目前的溫度篩選策略有最佳溫度篩選策略、即時控制溫度策略、衡量過飽和度法及循環溫度策略。
樣品純度和均一性
蛋白質樣品的純度和均一性是蛋白質結晶非常重要的兩個因素。純度可通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳和質譜測定。蛋白質的二級結構可以使用傅立葉變換紅外分光法和紅外圓二色譜法測定。樣品均一性可通過動態或靜態光散射（SLS）測定。SLS測定均一性時，通過分析透射光強度可獲得蛋白質分子的摩爾質量。SLS可檢測蛋白質樣品的質量及溶液聚合狀態。
沉澱劑
能夠降低蛋白質溶解度的化合物被稱為沉澱劑。沉澱劑通過3種機理髮揮作用：改變水分活度、改變溶劑的介電常數和增強空間排阻。不同作用機制的沉澱劑之間互換性很小。不同的沉澱劑在結晶過程中可能會產生協同作用，最終促進蛋白質晶體生長。
pH值
蛋白質中的胺基酸殘基側鏈含有大量的可電離基團，因此體系pH值的微小改變可導致蛋白質溶解度的變化。pH值可改變蛋白質大分子間鹽橋和氫鍵的數目和作用力，這兩種鍵對形核和晶體生長起著至關重要的作用。靜電相互作用在蛋白質分子的特異性結合，蛋白質水合作用及與小分子、離子相互作用方面起著重要作用。一般地，能夠保持蛋白質天然摺疊狀態的pH值更有利於促進蛋白質晶體的形成。
電場
使用高壓電場可以控制晶核的形成和結晶熱力學過程。通過控制電流、電壓、頻率及電極材料等可以控制晶體形核數量以有利於產生高衍射質量晶體。溶液pH可導致蛋白質帶電性質的不同，因此形核可發生在陰極或者陽極。電場對形核速率的影響與液相、固相之間的介電常數差異有關。離子強度越大電場的影響也就越大。
套用
2006年，Ma課題組用中空纖維微孔疏水膜對溶菌酶進行了結晶，並研究了沉澱劑和添加劑對結晶的影響，結果發現，微孔疏水膜作為非均勻成核的表面，不僅減少了結晶的誘導時間和初始蛋白質的濃度，而且可以更好地控制結晶的過程。以NaCl和NaSCN為沉澱劑，加入甘油、PEG4000、PEG6000等物質，有利於縮短晶體培養的時間，得到更大的溶菌酶晶體。
2008年，Zang等用聚偏氟乙烯中空纖維微孔膜對溶菌酶結晶的各種影響因素進行了系統的研究，研究發現，蛋白濃度、洗脫液的濃度和流速、沉澱劑濃度、結晶溶液的流速、pH值、結晶溶液的離子強度等都對晶體的形成和晶型有影響。2010年，該課題組又以木瓜蛋白酶為對象，採用動態膜結晶技術，得到了較大尺寸的木瓜蛋白酶晶體。
