《農桿菌介導RNA干擾抑制核盤菌致病相關基因的研究》是依託吉林大學，由張艷華擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：農桿菌介導RNA干擾抑制核盤菌致病相關基因的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張艷華
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
核盤菌是以同宗配合進行有性生殖的重要植物病原真菌，宿主範圍廣泛，造成巨大經濟損失，核盤菌的相關研究成為植物病理學家關注的焦點。本項目以核盤菌為對象，以本課題組已建立的農桿菌介導核盤菌轉化體系、與核盤菌有性生殖相關的SsMADS基因、核盤菌子囊盤表達序列標籤為基礎，搜尋靶基因siRNA位點，合成編碼髮夾RNA的模板DNA克隆到含有hpRNA表達元件的農桿菌雙元載體上。利用農桿菌轉化體系將靶基因hpRNA的表達盒整合到基因組中，實現siRNA體內持久轉錄，獲得靶基因抑制突變株。分析mRNA、蛋白質表達水平，結合表型和致病力變化，闡明SsMADS基因功能，挖掘未知功能基因，為揭示核盤菌致病的分子機理，有效控制作物菌核病提供理論依據。同時，建立農桿菌轉化與RNAi相結合研究基因功能的新策略，解決真菌siRNA導入的難題，延長RNAi作用時間，提高穩定性，為其他病原真菌基因功能研究提供借鑑。
結題摘要
核盤菌是以同宗配合進行有性生殖的重要植物病原真菌，宿主範圍廣泛，造成巨大經濟損失。本項目以核盤菌為對象，以核盤菌子囊盤cDNA文庫中篩選的MADS-box為靶基因，RNA干擾獲得靶基因抑制突變株，闡明MADS-box基因功能，揭示核盤菌致病的分子機理。本研究獲得結果：1. 克隆了核盤菌MADS-box基因SsMADS並登入GenBank（No. FJ869956）；2. 選擇SsMADS基因的保守片段，構建了靶基因的RNA干擾載體pS1-SsMADS（形成發卡結構）和pSD-SsMADS（帶有對向啟動子結構）；3. 建立了高效、穩定的核盤菌原生質體製備和農桿菌介導的轉化體系；4. 通過轉化將構建的RNA干擾載體轉入核盤菌，並獲得大量轉化子；5. 對轉化子進行篩選和分子驗證獲得一些表型改變突變株；6. 通過對轉化子SsMAD基因表達量、菌株生長速率和致病力分析，表明MADS-box在核盤菌菌絲生長、致病力等方面具有重要的調控作用。 本研究創新點與意義：1. 將農桿菌T-DNA插入與RNA干擾結合起來，用於核盤菌功能基因的研究，獲得了性狀穩定的轉化子，為基因功能的研究提供新策略；2. 闡明了核盤菌MADS-box轉錄因子SsMADS在菌絲生長、致病力等方面的重要調控作用，為有效控制菌核病提供理論依據；3. 建立了穩定、高效的RNA干擾技術體系，為今後研究核盤菌基因功能奠定基礎，也為其它病原真菌研究提供借鑑。對外交流：2012年6月邀請美國佛羅里達大學教授、美國植物病理學會病原真菌委員會副主席Jeffrey A. Rollins來吉林大學開展一系列學術交流活動，為核盤菌研究提出了寶貴建議。2012年、2013年、2014年課題組多名成員分別赴青島農業大學、武漢華中農業大學、瀋陽農業大學參加“中國植物病理學會學術年會”及“第十五屆國際核盤菌研討會”，與國內、外知名專家進行了廣泛的學術交流並投稿。研究成果：培養研究生2名，發表SCI論文3篇，會議論文3篇。所指導的研究生畢業論文“核盤菌MADS-box轉錄因子SsMCM1功能的研究”被評為吉林大學優秀碩士論文，項目負責人被評為“吉林大學優秀碩士學位論文指導教師”。2013年課題組研究成果“核盤菌子實體形成機制及大豆菌核病綜合防控技術的研究與套用”獲吉林省科學技術一等獎。
