《超長DNA序列體外簡易高效擴增技術的研製》是依託哈爾濱工業大學，由張治洲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：超長DNA序列體外簡易高效擴增技術的研製
- 依託單位：哈爾濱工業大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張治洲
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
國內外尚無報導可以簡易高效地擴增超長(50-100kb)DNA序列的技術。少量國際產品可以通過PCR擴增出來30-40kb的序列，但價格極其昂貴且擴增成功率未知。原因之一是國內外仍不完全清楚長片段擴增過程中的問題癥結。癥結之一是長片段DNA在熱循環過程中DNA序列本身之間的非目標性相互配對程度較高,不同位置的序列之間熱動力過程也難以協調一致,嚴重阻礙序列的有效延伸.近年來我們研製納米基因擴增技術過程中體會到：納米材料與DNA之間的相互作用可能使熱循環過程中DNA結構的有序化程度增加，繼而降低非特異性擴增程度或部分化解擴增困難。我們的初步數據表明,納米碳管對長PCR（大於10kb）的增效作用十分明顯。充分發揮納米碳管的潛在模板作用並與其它有利於長PCR擴增的增效試劑充分組合起來,結合國際上最先進的長PCR技術之若干考慮點,很有可能催生低成本的高效穩定的超長PCR技術的誕生。
結題摘要
本項目基本完成了預定任務。主要成果是： （1）通過對77種碳納米材料、常見的10種PCR增效劑（如乙二醇，1-2-丙二醇，海藻糖，DMSO，甜菜鹼等）、2種金屬納米材料（納米金，納米銀）、96種酵母細胞核內小分子的單因素篩選機雙因素組合篩選以及少量多組合篩選【總共使用引物73對，含20對一般PCR引物，38對高GC擴增引物，15對長PCR引物。每種因素都通過58對引物擴增過濾，效果良好者20種因素進行兩組合篩選，效果最好者再施以15對長PCR引物】，發現了6個PCR增效小分子，其中inosine, isoleucine和 uridine三組合可以有效擴增超過20kb DNA; (2)對超長PCR擴增中遇到的若干技術問題【延伸錯配；DNA熱變性復性的下帶；脫嘌呤；聚合酶夥伴分子；諸因素之間協同效應等】有了更深入的認識；但是這些問題尚不能通過簡單的添加納米材料來解決；（3）在上述研究基礎上我們提出了有效納米化的概念，是指擴增反應成分與增效劑之間如果能夠在微納米尺寸內提供類似細胞核內天然的DNA複製環境，則DNA擴增效率應該可以繼續提高。該構想指導我們在本項目中篩選一批細胞核內小分子並初步獲得成功。（4）發表了5篇SCI文章，3篇EI檢索文章，1篇核心期刊文章，申報了7個國家發明專利。項目期間上述7個專利及前期相關專利陸續獲批，這樣所涉及專利共有10項申報，獲批共6項。
