質譜成像

質譜成像是以質譜技術為基礎的成像方法，該方法通過質譜直接掃描生物樣品成像，可以在同一張組織切片或組織晶片上同時分析數百種分子的空間分布特徵。簡單而言，質譜成像技術就是藉助於質譜的方法，再配套上專門的質譜成像軟體控制下，使用一台通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來成像的方法。

基本介紹

• 中文名：質譜成像
• 外文名：mass spectrometry imaging
• 簡介：藉助於質譜的方法
• 特點：質譜儀來成像的方法。
• 簡稱：MSI

簡介

最早的質譜成像技術是基質輔助雷射解吸電離（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）質譜分子成像技術，由范德堡大學（VanderbiltUniversity）的Richard Caprioli等在1997年提出，他們通過將MALDI質譜離子掃描技術與專業圖像處理軟體結合，直接分析生物組織切片，產生任意指定質荷比（m/z）化合物的二維離子密度圖，對組織中化合物的組成、相對豐度及分布情況進行高通量、全面、快速的分析，可通過所獲得的潛在的生物標誌物的空間分布以及目標組織中候選藥物的分布信息，來進行生物標誌物的發現和化合物的監控。

原理

MSI技術的工作原理：首先以適當的方式獲取和製備待測樣本，質譜儀按照預先設定的採集程式，利用雷射或高能離子束等掃描樣本，使其表面的分子或離子解吸離子化，再經質量分析器獲得樣本表面各像素點離子的質荷比和離子強度，藉助質譜成像軟體在各像素點的質譜數據中搜尋任意指定質荷比離子的質譜峰，結合其對應離子的信號強度和其在樣本表面的位置，繪製出對應分子或離子在樣本表面的二維分布圖；繼而採用上述軟體對樣本連續切片的二維分布圖進行進一步數據處理，獲得待測物在樣本中的三維空間分布。

獲取與製備

樣本製備過程是影響質譜成像結果真實性和準確性的關鍵環節，其處理方法和技術與待測物自身的性質、所處的樣本類型和狀態密切相關。通常，MSI技術用於藥學研究多以動物、組織、細胞和固體製劑作為分析對象。

收集與固定

恰當而迅速的樣本收集與固定是維持樣本中分子或離子的真實空間分布和豐度的保證。一般常用頸椎脫臼、斷頭、麻醉放血、吸入CO2等方法處死動物以獲得整體樣本，應注意不同處死方法對特定器官中待測物可能產生的影響。器官等組織樣本可由活體組織檢查或動物解剖獲得。細胞樣本可以從培養基中分離。

為避免待測物的移位和降解，樣本一經收集應迅速固定。器官等組織樣本和整體動物樣本最常用的固定方法是快速冷凍。組織樣本通常冷凍於液氮或乾冰預冷的異戊烷中；整體動物樣本則多置於乾冰，正己烷浴中。經過快速冷凍的樣本，在 -70℃以下儲存時間1年內可以保持相對穩定，獲得的MSI結果可靠。採用福馬林固定石蠟包埋保存活檢樣本時，可通過對樣本表面噴塗反應性基質或進行原位酶解來消除福馬林引起的蛋白質共價交聯。快速可控的熱處理多用於防止室溫下酶因活性恢復而降解待測物，但因熱處理可能細微地改變樣本的形態結構，因此只適用於腦、腎、移植瘤等細胞排列緊密的組織。採用冷凍固定法可以很好地維持細胞的形態和細胞內可擴散離子的空間分布。為固定細胞，需先採用維持細胞滲透壓和酸鹼平衡的甲酸銨溶液洗去細胞表面的鹽類，然後快速冷凍並進一步冷凍乾燥，以除去甲酸銨和水。當使用化學固定法(如戊二醛作為固定劑)時，應注意其可能引起蛋白質共價交聯，從而使膜蛋白喪失維持細胞內外離子濃度梯度的功能，不利於可擴散離子的分布研究。

製備

組織、整體動物和固體製劑通常需要製成切片。切片前應根據樣本性質選擇是否需要包埋來維持樣本在切片過程中的完整性。對於眼組織等脆弱的組織、整體動物等較大的樣本以及不易完整切片的固體製劑常需要作包埋處理：組織樣本可用純水或明膠包埋；整體動物樣本和固體製劑可用羧甲基纖維素包埋。切片通常採用冰凍切片機，溫度控制在-16℃~-26 ℃；一般組織密度越大，切片溫度越高。切片的厚薄也很重要：切片過薄，容易在轉移過程中撕裂；切片過厚，則不利於清洗除去一些對離子信號有干擾的物質且導電性差。

樣本轉移至質譜靶主要通過融裱法和膠帶法，分別是在室溫下直接將冷凍組織切片粘到靶上，或用導電雙面膠將樣本固定在質譜靶上。固體製劑切片和整體動物切片通常使用膠帶法轉移。樣本轉移至質譜靶後，需立即對載有樣本的質譜靶進行乾燥處理以保持樣本穩定。常用的乾燥方法有冷凍乾燥、真空乾燥、溶劑脫水乾燥和氮氣吹乾。

處理

乾燥後的樣本一般可直接進行質譜分析，複雜樣本中特定待測物的檢測常需採用溶劑清洗、表面酶解和化學衍生化等對分析表面進行適當處理。

研究表明，用適當溶劑清洗載有樣本的質譜靶，既能起到脫水固定作用，還能顯著改善質譜測定結果。如蛋白組學分析時，常用70%～100%乙醇洗去抑制蛋白質離子化的小分子和脂質，以增強多肽、蛋白質的檢測靈敏度；而分析小分子時，則應儘量避免有機溶劑清洗，除非已明確待測物在所用溶劑不溶或幾乎不溶。分析脂質和小分子藥物時，使用特定pH的緩衝液清洗組織切片，可以除去內源性鹽類等抑制離子化的物質，以提高檢測信號強度。甲酸銨溶液可用於細胞表面鹽類的清洗，既維持細胞滲透壓和酸鹼平衡，又不影響細胞形態。

由於MSI常用的離子化方式對多肽的檢測靈敏度顯著高於對完整蛋白質的檢測靈敏度，故蛋白質原位分析時，有採用胰蛋白酶先對樣本表面的蛋白質進行原位酶解，產生相對分子質量範圍在400～3500的多肽後再檢測的報導。但因酶解過程中，待測物可能發生移位，內源性酶活性也可能恢復，因此原位酶解方式主要用於內源性蛋白質的鑑定，而非定量分布研究。

對於難電離的物質或者存在內源性背景干擾，在樣品表面進行化學衍生化將有利於待測物的MSl分析。

質譜成像分類

這種方法可用於小分子代謝物，藥物化合物，脂質和蛋白，而且質譜成像能相對快速的利用許多分子通道，完全無需特殊抗體。下面列出五種先進的質譜成像方法。

MALDI質譜分子成像技術

MALDI 質譜分子成像是在專門的質譜成像軟體控制下，使用一台通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來完成的。被用來研究的組織首先經過冰凍切片來獲得極薄的組織片，接著用基質封閉組織切片並將切片置入質譜儀的靶上。通過計算機螢幕觀察樣品，利用MALDI 系統的質譜成像軟體，選擇擬成像部分，首先定義圖像的尺寸，根據尺寸大小將圖像均分為若干點組成的二維點陣，來確定雷射點轟擊的間距。雷射束通過這個光柵圖案照射到靶盤上的組織切片，軟體控制開始採集質譜數據，在質譜儀中，雷射束對組織切片進行連續的掃描，組織樣品在雷射束的激發下釋放出的分子被質譜儀所鑑定從而獲得樣品上每個點的質荷比（m/ z）信息，然後將各個點的分子量信息轉化為照片上的像素點。在每個點上，所有質譜數據經平均化處理獲得一幅代表該區域內化合物分布情況的完整質譜圖。儀器逐步採集組織切片的質譜數據，最後得到具有空間信息的整套組織切片的質譜數據。這樣就可以完成對組織樣品的“分子成像”。設定m/ z 的範圍，即可確定該組織區域所含生物分子的種類，並選定峰高或者峰面積來代表生物分子的相對豐度。圖像中的彩色斑點代表化合物的定位，每個斑點顏色的深淺與雷射在每一個點或像素上檢測到的信號大小相關。

電噴霧電離技術

一般質譜成像方法由於體積龐大，重量重，需要冗長的樣品準備階段，因此並不適用於即時成像（bedside applications），比如說要幫助外科醫生進行實時的腫瘤邊界成像監控，那么就要尋找新的方法了。
一種稱為電噴霧電離技術（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技術解決了這個問題。DESI技術於2004年首次提出，由於這一方法具有樣品無需前處理就可以在常壓條件下，從各種載物表面直接分析固相或凝固相樣品等優勢而得到了迅速的發展。
這種方法的原理是帶電液滴蒸發，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當液滴蒸發到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊的質子化和去質子化的蛋白分子DESI與另外一種離子源：SIMS（二次離子質譜）有些相似，只是前者能在大氣壓下游離化，發明這項技術的普渡大學Cooks博士認為DESI方法其實就是一種抽取方法，即利用快速帶電可溶微粒（比如水或者乙腈acetonitrile）進行離子化，然後衝擊樣品，獲得分析物的方法。

APIR MALDI/LAESI技術

了解細胞的內部成分是理解健康細胞不同於病變細胞的關鍵。但是直到目前為止，唯一的方法是觀察單個細胞的內部，然後將其從動物或植物中移除，或者改變細胞的生存環境。但是這么做的話，會使細胞發生變化。科學家還不是很清楚一個細胞在病變時與健康細胞的差別，或者當它們從一個環境移到另一個環境中產生的變化。

來自華盛頓大學Akos Vertes教授希望能從另外一個方面來進行活細胞分析，在他的一項關於活葉樣品中初級和次級代謝產物分布的研究中，研究人員發現葉片中積累基質很厚，常導致光譜末端低分子量部分模糊，而且基質輔助雷射解析電離（MALDI）質譜分析需要在真空中進行，但活體樣本在真空中無法存活。
實際上，MALDI質譜分析的原理是將分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用雷射照射晶體時，由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹並進入氣相。而生物樣品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波長的光能激活水中氫氧鍵。因此Vertes等人想到複合兩種技術來解決這一問題。首先他們利用大氣壓紅外線（an atmospheric pressure infrared，APIR）MALDI雷射直接激活組織中的水分，使樣品氣化，就像是組織表面發生了細胞大小的核爆炸，從而獲得了離子化微粒，進入質譜中進行分析。但是並不是所有的氣化微粒都帶電，大部分其實是不帶電的，會被APIR MALDI遺漏。
為了捕捉這些中性粒子，Vertes等人採用了第二種方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，雷射燒蝕電噴霧電離)，這種方法能捕捉大量帶電微滴的微粒，然後重新電離化。通過對整個樣品進行處理，複合這兩種方法，就能覆蓋更多的分子，分析質量更高。
與一般質譜成像過程不同，Verte的方法還在成像中增加了高度，從而實現了3D代謝物成像。這項技術的解析度是直徑10mm，高度30mm，這與生物天然的立體像素相吻合，這樣科學家們就可以獲得天然構像。

3D成像——二次離子質譜技術

質譜成像技術能將基質輔助雷射解吸電離質譜的離子掃描與圖像重建技術結合，直接分析生物組織切片，產生任意質荷比(m/z)化合物的二維或三維分布圖。其中三維成像圖是由獲得的質譜數據，通過質譜數據分析處理軟體自動標峰，並生成該切片的全部峰值列表檔案，然後成像軟體讀取峰值列表檔案，給出每個質荷比在全部質譜圖中的命中次數，再根據峰值列表檔案對應的點陣坐標繪出該峰的分布圖。
但是一般的質譜成像技術不能對一些攜帶大分子碎片的化學成分進行成像，來自賓夕法尼亞州州立大學的Nicholas Winograd教授改進了一種稱為二次離子質譜（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以對樣品進行完整掃描，三維成像。

這種技術具有幾個優點：速度快（－10,000 spectra per second），亞細胞構造解析度（－100 nm），以及不需要基質。但是另外一方面，不同於MALDI方法，SIMS方面不是一種“軟”技術，這種方法只能對小分子成像，因此常常需要進行粉碎。
Winograd教授改進了這一方法，他利用了一種新型SIMS光束（carbon-60 磁性球），這種新光束比傳統的SIMS光束對物體的化學損傷更小。C60同時撞擊樣品表面，類似於“一陣爆炸”，這樣重複的轟擊使得研究人員能深入樣品，進行三維分子成像，Winograd教授稱這個過程是“分子深度成像”（molecular depth profiling）。
C60的能量與其它的離子束相當，卻不到達樣品表面以下，這樣樣品可以連續地被逐層剝離，研究人員就可以得到縱面圖形，最終獲得三維的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液將矽的薄片包裹起來並進行SIMS實驗，隨著薄膜逐漸被C60剝蝕，可以獲得糖和肽的穩態信號。最終，薄膜完全剝離後就可以獲得矽的信號。如果用其它的射線或原子離子代替C60 ，粒子束會快速穿過肽膜而無法提供有關生物分子的信息。因此這種方法具有良好的空間解析度，能夠獲得巨噬細胞和星型細胞的細胞特徵和分析物的分布情況。
這裡還要說到一點，SIMS和上一技術（APIR MALDI/LAESI技術）都可以對三維成像，但兩者也有差別，SIMS方法中，採用高能離子轟擊樣品，逐出分析物離子（二級離子），離子再進入質量分析器。MALDI方法則用雷射輻射樣品使之離子化，另外SIMS探針可以探測到100nm的深度，能提供納米級的解析度，而MALDI可以探測更深，但空間解析度較低。

納米結構啟動質譜技術

質譜在檢測生物分子方面有很大潛力，但現有方法仍存在一些缺陷，靈敏度不夠高和需要基質分子促使分析對象發生離子化就是其中之二。比如說，需要溶解或者固定在基質上的方法檢測代謝物，較易錯判，因為這些代謝物與那些基質常常看上去都一樣。另外基於固定物基質的系統也不允許研究人員精確的判斷出樣品中某一分子到底來自於哪兒。來自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士發明了一種稱為納米結構啟動質譜（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技術，這種技術能以極高的靈敏度分析非常小的區域，從而允許對肽陣列、血液、尿和單個細胞進行分析，而且還能用於組織成像。
NIMS利用了一種特製的表面，這種多孔矽表面上聚集了一種含氟聚合物，這些分子在受到雷射或離子束照射時會猛烈爆發，這種爆發釋放出離子化的分析物分子，它們被吸收到表面上，使其能夠被檢測到。這種方法利用雷射或離子束來從納米尺度的小囊中氣化材料，從而克服了一般質譜方法缺少所需的靈敏度和需要基質分子促使分析對象發生離子化的缺陷。
通過這種方法可以分析很多類型的小分子，比如脂質，糖類，以及類固醇，雖然每一種分析材料需要的含氟聚合物有少許差別，但是這是一種一步法的方法，比MALDI簡單多了——後者需要固定組織，並添加基質。
由於含氟聚合物不能很好的離子化，因此會發生輕微的光譜干擾，而且由於離子化過程是“軟性”的——就像MALDI，所以NIMS產生的生物分子是整塊離子化，而不是片段離子化。不過這種技術對於完整蛋白的檢測靈敏度沒有MALDI高。

套用

腦腫瘤：2001年Stoeckli 等首次證實質譜成像技術在腫瘤研究中的巨大潛能，該文論述了如何套用質譜成像技術揭示膠質母細胞瘤組織切片的化學空間結構。該研究結果顯示，蛋白胸腺素β4常出現在腫瘤團塊增殖最活躍的部分，而蛋白S100A4則出現在腫瘤團塊的中心。 隨後質譜成像技術被證實可直接進行組織分析定位神經膠質瘤，並進行神經膠質瘤的惡性程度分級。

肺癌：Groseclose 等套用質譜成像技術對包含 112 例針吸活檢標本的小型肺癌組織晶片進行了研究。 首先,由一位病理學家在光鏡下對該組織晶片的HE染色切片進行分析劃分每一例活檢標本的癌區、癌旁區和正常組織區。 隨後，來自相同活檢標本的未經病理標註組織晶片與病理標註組織晶片的HE染色切片進行匹配比對，劃定未經病理標註組織晶片的癌區、非癌區範圍，最後用未經標註的組織晶片進行組織溶解質譜成像。進行質譜成像的組織晶片上，一部分針吸活檢組織作為訓練組，並用病理學家的診斷對訓練組針吸活檢組織的質譜信號進行標註，建立分類模型。 這個包含73個胰蛋白酶肽峰的基於支持矢量機的分類模型對腺癌的識別準確率為97.9%，對鱗癌的識別準確率為98.6%。

乳腺癌：雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2狀態與乳腺癌的診斷及治療密切相關。近年來，有研究表明，對上述3種蛋白mRNA的多重檢測能大幅提升乳腺癌的診斷水平，並指導乳腺癌的個體化治療。