負染色技術

負染色又稱陰性染色，是相對於普通染色（稱正染色）而言的。

負染色技術是一種製備電子顯微鏡樣品圖像呈現復反差的技術。用於觀察樣品中的顆粒性物質或生物大分子。用金屬鹽對鋪展在載網上的樣品進行染色，使整個載網都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。染色後，在電鏡下觀察時，被觀察的對象為亮的，背景為暗的。

基本介紹

• 中文名：負染色技術
• 外文名：Negative staining technique
• 屬於：負染
• 分類：色技術

背景

負染色首先由Hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷鎢酸染色後，發現圖像的背景很暗，而病毒象一個亮晶的"空洞"被清楚地顯示出來。在超薄切片的染色中，染色後的樣品電子密度因染色而被加強，在圖像中呈現黑色。而背景因未被染色而呈光亮，這種染色稱為正染色。而負染色則相反，由於染液中某些電子密度高的物質(如重金屬鹽等)"包埋"低電子密度的樣品，結果在圖像中背景是黑暗的，而樣品像"透明"地光亮。兩者之間的反差正好相反，故稱為負染色。

對於負染色的機制目前還不十分了解。對顆粒狀的生物材料的研究而言，負染色技術與超薄切片方法相比具有解析度高(可達15Å)，簡單快速等優點。因此，在生物學研究中得到越來越廣泛的套用。它可以顯示生物大分子、細菌、病毒、分離的細胞器以及蛋白質晶體等樣品的形狀、結構、大小以及表面結構的特徵。尤其在病毒學中，負染色技術成為不可取代的實驗技術。

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負染色液的製備

用作負染色的負染色劑應具有：

較強的電子散射能力以產生足夠的圖像反差； 熔點高，在電子束的轟擊下不會升華； 溶解度大，不易析出沉澱； 在電鏡下不呈現出可觀察到的結構； 分子小，容易滲入不規則表面的凹陷處； 與樣品不起化學反應等。 目前最常用的負染液是磷鎢酸、磷鎢酸鉀和磷鎢酸鈉(分別簡稱為PTA、KPT、NaPT)。此外醋酸鈾、甲酸鈾、矽鎢酸、鉬酸銨等也常作負染色劑用。

它們的配製方法如下：

磷鎢酸、磷鎢酸鈉、磷鎢酸鉀溶液通常用雙蒸水或磷酸緩衝液配製成1%～3%的溶液，使用時套用1 mol/L氫氧化鈉溶液將負染色液的pH值調至6.4～7.0或實驗所需的值。 醋酸鈾：通常使用雙蒸水配製成0.2%～0.5%水溶液(pH4.5)。醋酸鈾染色液應是新鮮的，最好使用前配製。醋酸鈾溶解需15～30分鐘，在黑暗中能穩定幾小時，使用前用1mol/L的氫氧化鈉溶液將pH值調至4.5。 甲酸鈾：用雙蒸水配製成0.5%～1%水溶液，pH值為3.5，使用時用1mol/L的氫氧化鈉溶液將pH值調至4.5～5.2。 鉬酸銨：用雙蒸水配製成2%～3%水溶液，使用時用醋酸銨將pH值調至7.0～7.4。鉬酸銨對有界膜的生物材料具有特別良好的染色值。 [編輯]

染色方法

懸滴法 用一根細滴吸管吸一滴樣品懸液滴在有膜的銅網上，滴樣時要防止銅網被液體吸到管上來或翻轉而被污染。如果用Formvar膜時，在制好膜後，可以直接在粘於濾紙上的銅網進行負染色操作。如果用碳膜時，要用鑷子夾著銅網，滴液後靜置數分鐘，然後用濾紙從銅網邊緣吸去多餘的液體，滴上負染色液，染色1～2分鐘用濾紙吸去負染色液，再用蒸餾水滴在銅網上洗1～2次，用濾紙吸去水，待乾後可用於電鏡觀察。乾燥時，由於表面張力的作用，某些敏感的材料可能受到損傷，可用戊二醛或四氧化鋨預固定。預固定在滴樣之後進行。

噴霧法 將染色液和懸液樣品等量混合，用特製的噴霧器噴到有膜的銅網上，待乾後可用於電鏡觀察。噴霧法的優點是霧滴較小，分布均勻，不易凝結成塊。但操作較麻煩，溶液混合時易產生沉澱，並且需要耗費較多的樣品和染色液，尤其容易造成病毒擴散，故此法不常用。

漂浮法 先將帶有支持膜的銅網在懸液樣品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然後再在負染色液的液滴上漂浮。在漂浮期間，樣品和染色液被吸附在銅網的支持膜上，漂浮時間與懸滴法相近。

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操作中的注意事項

一個理想的負染樣品的圖像應是均勻的，在一萬倍的放大倍率下，圖像出現一些薄薄的染色斑塊，其特點是沒有明顯的邊緣，染色斑由中央向邊緣由深到淺，有一個逐漸變化的過程，如同中國水墨畫的潤色一樣。在3～4萬倍觀察時則可見到反差良好而柔和的生物結構。而與此相反，黑白截然分明，缺乏由淺到深的中間色調，或在明亮的載網上出現顆粒性團塊，則是染色失敗的表現。因此，雖然負染色方法簡單，但要獲得理想的負染色效果和實驗的重複性卻不大容易。下列因素在操作中需加以注意：

懸液樣品的純度 待染色的懸液樣品雖然不要求很純，但如果雜質太多，如大量的細胞碎片，培養基殘渣，糖類以及各種鹽類結晶的存在將會干擾染色反應和電鏡的觀察。尤其是不要有過多的糖類，因為在電子束的轟擊下，糖類容易碳化而有礙觀察，因此最好進行適當的提純。

懸液樣品的濃度 樣品懸液的濃度要適中，否則太稀時在電鏡下尋找樣品將很困難；太濃時，樣品的堆集會影響觀察。因此第一次制樣時，同時用幾種濃度的樣品進行滴樣，從而採用濃度適中的銅網進行觀察。一般負染色技術通常要求每份樣品至少含有10^7/ml目標顆粒，才能被觀察到。

樣品和染色液的均勻分布問題 生物大分子樣品或病毒樣品最好使用碳膜作支持膜。使用其它支持膜，在電鏡觀察時往往會發生樣品漂移，而不容易拍攝到好的照片。但是由於碳膜的疏水性會使樣品及染色液凝集，在電鏡觀察時往往由於樣品和染色劑濃密的堆集而無法看清樣品的結構細節。為了提高染色效果，需要設法促進樣品和染料的均勻分散，可採用以下方法：

{使用分散劑} 常用分散劑有牛血清蛋白(BSA)，適用於高度純化的顆粒性懸液。方法是把0.005%～0.05%牛血清蛋白溶液加到樣品懸液內，所加量無嚴格的規定，先加數滴，如果仍不見效可適當增加；也可以直接用0.01%BSA作為離心沉澱物的稀釋液。此外，也可以用桿菌肽，按30～50μg/ml的濃度用蒸餾水配製成溶液，用作沉澱物的稀釋液。或將樣品懸液，PTA和桿菌肽溶液三者等量混合後滴樣。 {親水性處理} 對碳膜進行親水性處理方法如下：把覆蓋在銅網上的碳膜放在離子濺射儀中，在10Pa～1Pa的真空中用離子轟擊(蝕刻)幾秒鐘，碳膜即由疏水性變為親水性。用這種碳膜就不存在樣品與染色劑凝集的問題。但要注意碳膜經親水性處理後，經過1～2天又會變為疏水性的，因此最好親水性處理後立即使用。 樣品懸液和染色液的酸鹼度問題 樣品懸液和染色液的酸鹼度會對負染色的結果產生較大的影響。為了確保生物樣品有足夠的緩衝條件，一般用2%醋酸銨或硫酸銨作緩衝液效果較好，並且使懸液的酸鹼度呈中性或稍偏酸為宜。

染色液的酸鹼度不僅影響到染色液的擴散，而且會對病毒的形態造成一定影響。負染色在製備過程中只要pH值有微小的變化就可能產生不同的形象，有時不僅不能獲得良好的負反差，相反會出現正染色的效果。某些負染色劑及其pH的參考值見表：

某些負染色劑及其pH參考表

負染色劑	濃度（%）	pH值	緩衝液
磷鎢酸鉀	2	6.0~7.0	醋酸銨
醋酸鈾	0.1~1	4.0~5.2	無
甲酸鈾	0.5~1	4.0~5.2	無
鉬酸銨	2~3	6.0~8.0	醋酸銨
鎢酸鋰	2	6.0~7.5	醋酸銨
硼酸鎢鈉	2	5.5~7.0	無

不同的樣品要求不同的pH值，因此，在具體套用時，不要生搬硬套，而應當做必要的摸索。

染色的時機

染色的時機十分重要。滴染色液的時機一般既不要在生物樣品完全乾了之後，更不應在載網上尚有肉眼可見的水珠時就著手染色。恰當的時機應是用濾紙吸去懸液之後稍待片刻，當肉眼看不出殘留的液體時滴加染色液。如果載網上尚有懸液殘存時就進行染色，或者完全乾後再染色，效果都不佳。

負染色引起的缺陷

負染色的套用，尤其有助於用電鏡研究小的、游離的懸浮物，如病毒，細胞器，如葉綠體，線粒體等。負染色方法染色本身，染色液的溶劑、離子組成、親水性、pH值和乾燥情況的變化都可引起缺陷。一種比較常見的缺陷是表現為白色的小球（圖\ref{Fig-Negtive-Flaw}）。在進行病毒形態鑑定觀察分析時，這種小泡的存在很容易誤導，尤其很容易被當作球狀病毒。一般樣品中的懸浮介質或染色液的pH值偏低時比較容易導致這種缺陷發生。

樣品的親水性，也很容易形成負染色缺陷。當樣品親水性差時，負染色結果經常顯示背景差，且樣品濃度等得不到真實的顯示，引起誤解。這時對樣品吸附介質，如Fomvar膜進行親水性的處理，如噴碳、離子蝕刻或採用新鮮製備的銅網等都會改善這種缺陷。

某些結構，如線粒體基粒、核糖體和蛋白質及其組裝成的纖維甚至病毒等，可以通過負染色（negative staining）電鏡技術觀察其精細結構。其解析度可達1.5nm左右。負染色是用重金屬鹽，如磷鎢酸或醋酸雙氧鈾，對鋪展在載網上的樣品進行染色，吸去多餘染料，樣品經過自然乾燥後，整個載網上都鋪上了一薄層重金屬鹽，從而襯托出樣品的精細結構。