豬肺炎支原體克隆致弱株

《豬肺炎支原體克隆致弱株》是江蘇省農業科學院畜牧獸醫研究所於1999年6月25日申請的專利，該專利的公布號為CN1244580，授權公布日為2000年2月6日，發明人是邵國青、金洪效、毛洪先、錢建飛、侯繼波、何家惠。

《豬肺炎支原體克隆致弱株》提供一株豬肺炎支原體（Mhp）無細胞培養弱毒株，該株毒力較弱、安全，有較強的免疫原性，可在無細胞培養基上培養。該株是由氣喘病豬病肺接種於二花臉豬進行人工發病，並進行豬肺炎支原體病原再分離，鑑定後在江蘇二號無細胞培養基中致弱培養至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是：CGMCCNo.0396。

2015年11月27日，《豬肺炎支原體克隆致弱株》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：豬肺炎支原體克隆致弱株
• 申請人：江蘇省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 申請日：1999年6月25日
• 申請號：991142764
• 公布號：CN1244580
• 公布日：2000年2月6日
• 發明人：邵國青、金洪效、毛洪先、錢建飛、侯繼波、何家惠
• 地址：江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街50號
• Int.Cl.：C12N1/20
• 代理機構：江蘇省專利事務所
• 代理人：徐冬濤、周新亞
• 類別：發明專利

專利背景

豬肺炎支原體（MycoplasmahyopneumoniaeMhp）是引起豬支原體肺炎（MycoplasmaPneumoniaeofswineMPS亦稱豬地方流行性肺炎、豬氣喘病）的主要病原，對養豬業造成重大的經濟損失。在豬呼吸道和其它部位還分離到豬鼻支原體（MycoplasmahyorhinisMpo）、豬絮狀支原體（MycoplasmaflocculareMf）、豬腹支原體（Mycoplasmasualvi）、脲原體（Ureaplasmas，尿原體）及多種無膽甾原體（Acholeplasmas），但這些支原體並不普遍，致病意義也較小。Mhp由Mare&Switzer及Goodwin&Whitlestone於1965年分離成功，菌體呈球型到短絲狀體，菌落很小，具有不明顯的中央隆起，在豬血清瓊脂平板上不產生膜，也不溶解馬、牛、豬、小雞紅血細胞，營養要求複雜，培養嚴格好氧。八十年代前，中國國內外完成Mhp的分離、鑑定、人工發病、診斷技術和藥物治療等系統研究。

但1999年前國際尚無豬肺炎支原體可無細胞培養的弱毒株，常規的豬肺炎支原體株（Mhp）或者毒力大，或者毒力弱而無免疫原性。

發明內容

專利目的

《豬肺炎支原體克隆致弱株》的目的是提供一株豬肺炎支原體（Mhp）無細胞培養弱毒株，該株毒力較弱、安全，有較強的免疫原性，可在無細胞培養基上培養。該株是由氣喘病豬病肺接種於二花臉豬進行人工發病，並進行豬肺炎支原體病原再分離，鑑定後在江蘇二號無細胞培養基中致弱培養至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。該株培養72-144小時，以特定PCR引物可擴增出的特異片段，對該株的探針有特異性雜交反應，擴增產物有特定基因序列。

技術方案

《豬肺炎支原體克隆致弱株》的目的可以通過以下措施來達到：支原體（Mycoplasma，M.亦稱霉形體），最早由Nocard和Roux（1898）由牛傳染性胸膜肺炎病例中分離到，第一種支原體即絲狀支原體牛型亞種（M.mycoidessubsp.bovi/M.mycoidessubsp.mycoides）分離後由於其性質難以界定，遂將這一大類微生物命名為類胸膜肺炎微生物（PPLO_S）。二十世紀五十年代中期，始用支原體這一名稱。1967年，Edward和Fnundt建議將其由裂殖菌綱分出來，單獨成立一個新綱：軟膜體綱（Mollicutes柔膜菌綱，軟皮體綱），支原體因缺少光合色素（葉綠素），有別於裂殖藻綱；缺少堅硬的細胞壁和細胞壁成份，有別於裂殖菌綱；可以進行無細胞培養而有別於濾過性病毒。它是最小的能夠自我複製的原核生物，基因組大小只有典型細菌的20-40％。國際細菌系統分類委員會軟膜體綱分類分會（ICSB-ISTM）將軟膜體綱分四個目：目I：支原體目（OrderI，Mycoplasmatales）；目II：昆蟲原體目（OrderII，Entomoplasmatales）；目III：無膽甾原體目（OrderIII，Acholoplasmatales）；目IV：厭氧原體目（OrderIV，Anaeroplasmatales）。支原體目下設一個科即支原體科（FamilyI，Mycoplasmataceae），科內置兩屬：支原體屬（Mycoplasma），屬內有120種；尿原體屬（Ureaplasma），屬內有6種，常見的動物支原體屬此兩屬。

Mhp克隆致弱株（以下簡稱JS-99株）的分類地位為：原核生物界（Procaryotae）、軟壁菌門（Teneribacteria）、軟膜體綱（Mollicutes）、支原體目（OrderI，Mycoplasmatales）、支原體科（FamilyI，Mycoplasmataceae）、支原體屬（Mycoplasma）、豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae）。

豬肺炎支原體迄今全世界只有一個種，其模式株為：J（ATCC25934，NCTC10110），YppII（ATCC25617，NCTC10127）。

MhpJS-99株經系列生化試驗證明為支原體屬成員，生長抑制試驗檢測血清型證明與豬肺炎支原體J株為同一種。

1999年前該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是：CGMCCNO.0396。

改善效果

《豬肺炎支原體克隆致弱株》與1999年6月之前的技術相比具有以下優點：

1、有免疫原性、毒力較弱且對豬安全；

2、能適應於KM2、Friis等無細胞培養基生長；

3、該弱毒株對二花臉和其它中國地方品種豬的免疫原性尚未測試，但安全性好，對二元雜交豬免疫保護率達80％以上。

技術領域

《豬肺炎支原體克隆致弱株》屬微生物新菌株。

權利要求

1.《豬肺炎支原體克隆致弱株》該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是：CGMCCNO.0396。

實施方式

下面對該菌株的培養及鑑定作進一步描述：

一、無細胞培養KM₂培養基組成及製法

Eagle’s溶液1000毫升、1.7％乳蛋白水解物溶於Dubeco-Vot’s磷酸緩衝液（即含10克水解乳蛋白）600毫升、自製鮮酵母抽出汁20毫升、健康豬血清400毫升、青黴素鉀鹽40萬單位、1％醋酸鉈溶液25毫升、0.4％酚紅水溶液3.5毫升。

所有材料低溫下用1NNaOH溶液校正其pH到7.4-7.6，Φ0.1微升分鐘ipore濾器過濾去除細菌和支原體後，分裝貯存於4℃冰櫃內備用。

二、豬肺炎支原體JS99株形態鑑定方法

瑞氏染色法鏡檢：塗片、固定、乾燥後，瑞氏染色，置顯微鏡下油鏡1600倍，可見分散的大量具有特定多形態的菌體。

三、豬肺炎支原體JS99株微粒凝集反應試驗鑑定方法

1.微粒凝集反應的原理：用一定比例的已知抗體血清與待檢培養抗原結合，會發生抗原—抗體凝集反應。由於此種支原體形小、凝集團塊肉眼不易察見，經塗片染色，在顯微鏡下放大觀察，可清晰地區別微粒凝集反應與非微粒凝集反應。有凝集反應可判斷培養抗原為豬肺炎支原體。

2.材料準備：

（1）抗原：豬肺炎支原體JS99株純粹培養物接種於江蘇2號培養基（KM₂pH7.4），37℃培養48—72小時，待pH降至6.8左右，並有均勻一致的輕微混濁時，塗片染色鏡檢。可見分布均勻而純粹的大量具有特定性多形態菌體，以此培養物作為微粒凝集反應抗原。

（2）J株對照抗原、標準陽性血清及標準陰性血清，由江蘇省農科院畜牧獸醫研究所豬病研究室提供。血清須無菌並在56℃水浴中30分鐘滅能。

（3）江蘇2號（KM₂）培養基。

（4）瑞氏（Wright’s）染色液。

3.操作方法：

（1）用不加陰性豬血清pG7.2的KM₂培養基將J株對照抗原、待鑑定培養抗原作10倍稀釋。

（2）取稀釋抗原0.8毫升，加滅活的標準陽性血清及標準陰性血清0.2毫升混合於滅菌小玻瓶中（可用10毫升鏈黴素瓶代替），用滅菌橡皮塞塞緊，於37℃中培養48小時後塗片。置37℃溫箱內乾燥後，用甲醇固定乾燥後用瑞氏染色液染色，染色時間視氣溫高低而定夏季3—5分鐘，冬、秋季15—20分鐘；用蒸餾水沖洗乾淨、乾燥後，置顯微鏡下油鏡1000—1600倍以上，觀察記錄照相。

（3）該試驗均應無菌操作。

4.判定結果：在顯微鏡油鏡觀察下，如支原體顯示均勻一致的分布，定為無凝集反應（—）；呈現小部分菌體凝集反應為（+）；大部分菌體凝集反應（++）；全部菌體凝集反應（+++）。J株對照抗原與陽性血清有++凝集反應，與陰性血清無凝集反應。豬肺炎支原體JS99株待鑑定培養抗原與陽性血清有++以上凝集反應。

5.說明：

（1）該法操作簡便，特異性高，可作為實驗室診斷鑑定的方法。

（2）套用此法鑑定豬支原體菌株，並證明：豬肺炎支原體JS99株與J株屬於同一種。

（3）在實驗室與豬鼻支原體、豬滑液支原體、萊氏不需膽甾支原體的高免兔血清作微凝反應，無交叉反應。

四、權利要求書所述之豬肺炎支原體JS-99株的P46基因鑑定試驗結果

P46基因是編碼Mhp細胞表面46KDa蛋白抗原的基因，該抗原可引起Mhp感染豬早期特異性免疫反應。該報告通過對弱毒MhpJS-99株P46基因的克隆測序，為MhpJS-99株的鑑定作分子標記。

1.材料與方法

1.1Mhp菌株與培養條件：MhpJS-99株培養物培養方法：培養基為km2培養基（製備方法略），種子繼代復壯後，1:10比例接種，37℃培養72小時，培養物pH由7.6降到6.8～6.6，並呈均一混濁狀態，無沉澱。培養物塗片瑞氏染色鏡檢，呈特異多形態菌體，無雜菌。培養物稀釋作液體培養變色單位（colourchangeunitccu）檢測MhpJS-99株濃度為10（7）～10（8）ccu/毫升。

1.2PCR引物的設計：從Internet下載Futo（1996）在GenBank登載的J株（ATCC25934）P46基因（命名：MYC46KDSA，1740bpDNA序列），該序列187～192為-10序列，222～230為RBS序列，235～1494為編碼P46抗原蛋白的CDS。用Goldkey軟體修正各種PCR產物設計指標，最終在320～1680獲得一對引物，在此區間內模板序列無HindIII、BamHI酶切位點，根據克隆質粒pUC19polylink酶切位點的要求，在引物5′和3′分別添加了HindIII和BamHI酶切位點及3個保護性鹼基，引物G+C％為53～56，無髮夾和二聚體，其序列為：（3′為反向互補）5′：GGCAAGCTTCAGGTTGTAGACAGACAG，3′：ACCGGATCCGTCACATCAGAAAGAGC。

1.3PCR模板的製備：MhpJS-99株培養物100毫升經0.05摩爾pH7.2PBS離心、洗滌3次後，沉澱以1毫升PBS懸浮。Mhp染色體DNA用BoehringerManuheim公司的HighpurePCRTemplatepreparationKit提純：吸取200微升Mhp懸液，加200微升結合緩衝液（含6Mguanidine-HCL，10mMurea，10mMTris-HCL，20％TritonX-100（v/v），pH4.4（25℃）），40微升蛋白酶k溶液（90毫克凍乾蛋白酶k溶於4.5毫升重蒸水，-20℃保存），立即混勻，72℃溫育10分鐘，再加100微升異丙醇，混合後反應液移入帶兩層玻璃纖維絨（吸附DNA用）的聚丙烯管，8000rpm1分鐘離心，棄液體。管中再加500微升沖洗液（含20mMNaCl，2mMTris-HCL，80％乙醇（v/v），25℃pH7.5），離心棄沖洗液，再重複沖洗後，加200微升預熱到70℃的DNA洗脫緩衝液（10mMTris，pH8.5，25℃），8000rpm離心1分鐘，收集Mph染色體DNA洗脫液，Backman毛細管紫外檢測儀測得洗脫DNA濃度為6ng/微升，可作PCR模板用。

1.4PCR擴增：引物由中科院上海植生所合成，每管為1個OD值，5′、3′引物分別含0.00370、0.00384μMDNA。分別加123、5微升、128、2微升滅菌重蒸水溶解，引物濃度均成為30pM/微升。TaqDNA聚合酶及緩衝液為Promega公司產，產品號C0010，濃度5u/微升，10X緩衝液含有：500mMkcl，100mMTris-HCL（pH9.0），1％TritonX100，15mMMgcl₂。dNTP，Promega公司產，含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2.5mM/微升。

PCR擴增儀：PerkinElmerDNAThormelcycler。擴增條件設定為：預變性：96℃8分鐘；94℃1分鐘，45℃1分鐘，72℃3分鐘，循環35次；延伸：72℃10分鐘。

PCR擴增：在0.5毫升eppendorf管內分別加入：模板2微升，5′引物2微升，3′引物2微升，10×緩衝液5微升，dNTP4微升，滅菌重蒸水35微升，總體積為50微升。加20微升滅菌石臘油後，96℃變性8分鐘，冷卻確至室溫後，迅速在反應液中加入1微升TaqDNA聚合酶，繼續進行循環和延伸反應，擴增產物以1％的瓊脂糖電泳測定。

1.5電泳與照相：PCR產物10微升加2微升6×凝膠加樣緩衝液（0.25％溴酚藍，4％（w/v）蔗糖水溶液，300mMNaoH，6mM/LEDTA），在1％瓊脂糖凝膠上按《分子克隆》方法電泳。電泳儀為Mupid-2微型DNA電泳儀（CosmoBioCo.LTD.生產），按8～10v/cm電泳45分鐘，凝膠在溴化乙錠（0.5微克/毫升，pH8.0，1×TAE）中染色30～45分鐘，紫外燈下檢查。凝膠相片拍攝和條帶分析用KodakDigitalScience1D系統，標準分子量參照系用寶靈曼公司的1kbDNALadder。

1.6電泳產物回收：PCR產物電泳後，用1％低融點（LMP）瓊脂糖回收（參照《分子克隆》）。LMP瓊脂糖塊加200微升pH8.0TE於65℃溫育5分鐘，瓊脂糖溶解後加入等量體積的蒸餾酚，混勻，12000rpm5分鐘離心，小心吸取上清，再等體積加入1:1（v/v）混合的酚、氯仿溶液，混勻，12000rpm5分鐘離心，再等體積加入氯仿抽提一次。最後吸出的水相加0.1體積3M/L乙酸鈉和2倍體積4℃的乙醇沉澱DNA，-20℃過夜。12000rpm10分鐘離心，棄上清，4℃75％乙醇小心漂洗沉澱，50微升重蒸水溶解，-20℃保存。

1.7P46基因PCR提純產物和PUC19質粒DNAHindIII、BamHI雙酶切和回收：在0.5毫升eppendorf管中進行：①P46基因雙酶切反應PCR提純產物32微升、BamHI10u/微升2微升、HindIII10u/微升2微升、BufferE10×4微升、反應總體積40微升②質粒Puc19雙酶切反應pUC190.5微克/微升、10微升BamHI10u./微升2微升、HindIII10u./微升2微升、BufferE4微升、滅菌重蒸水22微升、反應總體積40微升。37.5℃反應45分鐘，產物按1.6方法電泳回收。

1.8連線反應：Puc19回收液13微升、PCR產物酶切回收液36微升、T4DNA連線酶1u./微升5微升、10X連線酶緩衝液6微升、反應總體積60微升。

16～20℃連線12hr，取出其中的10微升轉化感受態細胞。

1.9轉化、篩選重組子按常規方法製備大腸桿菌JM105株的感受態細胞，將含60微升新鮮感受態細胞的eppendorf管置冰水中，加入1.8連線反應產物10微升，冰水中放置30分鐘，再於42℃水浴2分鐘，加入1毫升LB，37℃振盪培養1hr，稍加離心，去上清，約餘500微升。吸200微升塗布接種含有氨苄青黴素和已塗布40微升X-gal貯存液（20毫克/毫升二甲基甲醯胺、4微升異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）溶液（200毫克/毫升））作選擇性標記的瓊脂培養皿上，靜置10分鐘後，倒置平板37℃培養18小時，挑選白色單菌落，再接種於含100μg/毫升氨苄青黴素的LB培養管，37℃振盪培養8hr，提取質粒。1.10重組子質粒的鑑定提取的重組子質粒10微升按1.7中pUC19質粒雙酶切反應的方法以BamHI、HindIII雙酶切，酶切後電泳檢查。1.11克隆基因的測序中科院上海植生所進行，用酶法螢光分析系統測序，以P46基因5′PCR引物為寡核苷酸引物。

2.結果

2.1MhpJS-99株模板DNA的提取用石英毛細管吸取5～8微升模板DNA提取液，在BackmanDU-600spctrophotometer上測得OD₂₆₀為0.12，OD₂₈₀為0.06，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.0，證明核酸純度較高，模板DNA濃度為：0.12×50＝6ng/微升。

2.2P46基因的PCR擴增PCR產物以1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果經KodakDigitalScience1D照相分析，目的基因為1.37kb，與設計期待長度1377bp相一致，PCR產物濃度為0.025μg/毫升。

2.3重組質粒的酶切鑑定重組質粒經BamHI、HindIII雙酶切後產生2.6kb、1.4kb兩條帶，酶切結果表明約1.37kb的P46基因已插入pUC19。

2.4克隆基因的部分測序及序列分析

測序結果與J株P46基因序列及鹼基組成比較結果如下：

P：鹼基缺失。

表1.MhpJS-99株P46基因鹼基組成與J株的比較

比較J株和MhpJS-99株P46基因的部分結構基因的10～490鹼基，（J株位於376～857），在10～385位鹼基均相同，僅在202位J株基因由G變為A，在385～490之間有14處變異，分別為5個A缺失，5個A變為C，1個A變為T，1個G變為T，2個T缺失。總體上A、T的缺失或變異占87％。比較J株（366-867）和MhpJS-99株P46基因（1-501）的鹼基成分，J株G+C％為36.13，MhpJS-99株為37.72，後者略多。MhpJS-99株P46基因的測序，可為MhpJS-99株的鑑定作分子標記。

榮譽表彰

2015年11月27日，《豬肺炎支原體克隆致弱株》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。