觀賞植物花瓣和葉片的花色素苷降解機理研究

《觀賞植物花瓣和葉片的花色素苷降解機理研究》是依託華南農業大學，由張昭其擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：觀賞植物花瓣和葉片的花色素苷降解機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：張昭其
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

花色素苷含量決定觀賞植物葉色和花色的鮮艷程度，含量高低與其合成和降解速度密切相關。國內外對觀賞植物花色素苷生物合成進行了詳盡研究，但對其降解機理的研究極少。本項目擬在廣泛收集具有明顯花色素苷褪色現象的觀賞植物的基礎上，與無明顯褪色的相比較，分析褪色過程中花色素苷含量、花色素苷降解酶（PPO、POD、漆酶及花色素苷-β-糖苷酶）活性的變化規律，建立和完善觀賞植物花色素苷降解的PPO/POD-酚-花色素苷或漆酶-花色素苷降解模式，並克隆花色素苷降解酶基因，探討基因表達模式與花色素苷降解的關係，以評價這些酶與花色素苷降解的相關性；重點純化觀賞植物花色素苷-β-糖苷酶蛋白並進行序列測定，研究其酶學性質，把該基因在E.Coli或酵母中表達，得到重組酶並明確其花色素苷降解功能。本項目研究結果，對於深入了解植物花色素苷的降解機理和探討觀賞植物顏色調控措施均具有重要的理論和實踐意義。

結題摘要

本項目收集了多種具有褪色現象的觀賞植物如荔枝和龍眼、四季桂，鴛鴦茉莉、夾竹桃、大葉紫薇花瓣等，以無明顯褪色的紅背桂、玫瑰和康乃馨等為材料，詳細比較了褪色過程中觀賞植物花、葉、果的花色素苷含量變化、花色素苷降解相關酶活性變化。與紅背桂葉片對比，荔枝、龍眼、四季桂葉片從幼葉至成熟葉過程中，花色素苷含量逐漸降低，鴛鴦茉莉、夾竹桃、大葉紫薇花瓣在發育和衰老過程中花色素苷含量也不斷降低，這些材料均能檢測到高活力的PPO或POD活力或花色素苷降解酶活力，表明這些酶可能參與了花色素苷酶促降解。以部分純化花色素苷為底物，在荔枝中檢測到一種高活力花色素苷降解酶，隨後對其進行了分離純化，從SDS－PAGE膠上切取目的蛋白帶，質譜鑑定各片段均為漆酶（Laccase）片段。根據蛋白質片段克隆到荔枝LAC基因的全長cDNA序列，漆酶基因在果皮中的表達比PPO高1000倍以上。通過對不同底物VMAX/ KM比較，發現外源表兒茶素是該酶的最適底物，利用LH-20柱層析分離到漆酶底物，經HPLC AND MS/MS鑑定其為表兒茶素，而在荔枝果皮花色素苷降解和果皮褐變過程中，果皮表兒茶素逐漸降低。與葉片、莖、根等組織相比，漆酶基因和漆酶蛋白均在果皮中表達最高，免疫金和LAC::EGFP洋蔥表皮細胞定位表明，漆酶定位在液泡、內質網，這與它的功能是一致的。此外，還在鴛鴦茉莉和夾竹桃花瓣中發現高活力的β-糖苷酶，通過硫酸銨分級鹽析、DEAE Sepharose 和Sephadex G 200柱層析後，在鴛鴦茉莉花瓣中獲得了回收率為1.96％、純化倍數為40.93的β-糖苷酶，在夾竹桃花瓣中獲得了回收率為10.99％、純化倍數為15.51的β-糖苷酶，經進一步檢驗達到電泳純，獲得單一條帶。利用純化的β-糖苷酶，最兩種酶的酶學性質和底物專一性進行了研究。兩種來源的β-糖苷酶但對底物的專一性差異很大，從SDS－PAGE膠上切取目的蛋白帶，質譜鑑定結果表明，來自鴛鴦茉莉花瓣中的酶可能是β-D-xylosidase，來自夾竹桃花瓣中的酶可能是類似β-glucosidase的酶。鴛鴦茉莉花瓣的β-糖苷酶能使反應體系中的花色素苷吸收峰降低，而出現另外一個新的吸收峰，可能具有比較明顯的花色素苷降解活力，但夾竹桃花瓣β-糖苷酶則沒有發現花色素苷降解活力。