《血影蛋白αⅡ與肌動蛋白作用維持靜纖毛穩定》是依託上海交通大學，由於棟禎擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：血影蛋白αⅡ與肌動蛋白作用維持靜纖毛穩定
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：於棟禎
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
肌球蛋白VI基因突變導致毛細胞靜纖毛異常和感音神經性聾，靜纖毛是以β和γ肌動蛋白為骨架。本課題組前期進行了內耳毛細胞肌球蛋白VI相互作用蛋白的研究，通過免疫共沉澱、質譜分析、Western blot、免疫螢光技術等手段，發現血影蛋白αII與肌球蛋白VI作用，血影蛋白αⅡ與肌球蛋白VI和肌動蛋白在表皮板共表達，且血影蛋白αⅡ在靜纖毛根部強表達，提示血影蛋白αⅡ參與維持靜纖毛結構的穩定。然而血影蛋白αⅡ在靜纖毛結構的維持和聽功能中的作用尚不清楚。本課題擬研究血影蛋白αⅡ下調對體外培養基底膜肌動蛋白的表達和毛細胞靜纖毛的影響，並擬利用突變小鼠和斑馬魚基因敲除模型研究血影蛋白αⅡ下調對肌動蛋白的表達以及毛細胞形態包括靜纖毛形態和聽功能的影響。本課題旨在揭示血影蛋白αⅡ在內耳毛細胞靜纖毛穩定中的作用，為防治靜纖毛異常導致的耳聾提供理論基礎。
結題摘要
我們的前期研究發現血影蛋白αII與肌球蛋白VI相互作用，與肌球蛋白VI和F-肌動蛋白在表皮板共表達，且血影蛋白α Ⅱ在靜纖毛根部強表達，提示血影蛋白αⅡ參與維持靜纖毛結構的維持。本項目主要進行了血影蛋白α Ⅱ在靜纖毛結構和聽功能維持中作用的研究。在本研究中，我們利用Cas9/RNA 基因編輯技術建立Sptan1基因條件敲除小鼠以及通過RNA干擾技術下調HEI-OC1細胞血影蛋白αII的表達，並進行了形態學、分子生物學和聽覺電生理研究。結果發現：（1）血影蛋白αII mRNA和蛋白表達在P1和P3相對高表達，P7及P30表達減少；採用免疫螢光技術檢測不同時間點血影蛋白αII在耳蝸毛細胞的表達情況，發現其主要在表皮板和細胞膜內側表達。（2）利用Cas9/RNA 基因編輯技術構建 Sptan1-flox小鼠，Sptan1f/f小鼠與Gfi1-cre小鼠雜交，產生本研究用小鼠，即對照組小鼠為Gfi1-cre-/ +；Sptan1f/+， 實驗組小鼠Gfi1-cre-/ +；Sptan1f/f。（3）在P30行聽性腦幹反應（ABR），複合動作電位（CAPs）和畸變產物耳聲發射（DPOAEs）測試，發現實驗組小鼠ABR、CAPs和DPOAEs均顯著高於對照組小鼠。（4）通過免疫螢光技術和掃描及透射電鏡技術觀察P1、P3、P7、P15和（或）P30毛細胞靜纖毛和表皮板形態學的改變，靜纖毛完整性破壞和極性紊亂。（5）血影蛋白αII缺失導致外毛細胞快速進行性死亡，外毛細胞區域大量Caspase3激活信號，細胞核碎片化，提示外毛細胞的死亡是通過凋亡途徑實現的。（6）血影蛋白αΙΙ下調HEI-OC1細胞形態異常、F-肌動蛋白分布異常和血影蛋白βII表達異常。（7）靜纖毛的缺失與血影蛋白αΙΙ相關，實驗組小鼠蛋白表達正常，靜纖毛正常，如蛋白低或無表達，則靜纖毛形態異常。（8）血影蛋白αΙΙ敲除影響血影蛋白βII和F-actin的表達。這些結果表明血影蛋白αII在毛細胞靜纖毛和表皮板的發育和維持以及毛細胞存活的一個關鍵分子，提示血影蛋白αII對靜纖毛的發育和維持以及耳蝸毛細胞的存活至關重要。
