《蘋果跨膜轉運蛋白在S-RNase轉運中的作用機制研究》是依託中國農業大學，由李天忠擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：蘋果跨膜轉運蛋白在S-RNase轉運中的作用機制研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：李天忠
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
S核酸酶作為花柱S決定子，在配子體自交不親和反應中參與花柱花粉間信號識別。實驗證明蘋果S核酸酶產生在花柱引導組織細胞(TTc)內，在花粉管刺激下S核酸酶由花柱TTc內向細胞間及花粉管內轉運，發生自交不親和反應，而S核酸酶如何通過花柱TTc膜和花粉管膜尚不得而知。前一基金申請者利用酵母雙雜交篩選到一批與蘋果花柱S核酸酶互作的蛋白，其中包括花柱中的ABC跨膜轉運蛋白和花粉中糖類轉運蛋白B16片段。該項目予在此基礎上，首先利用RACE得到其基因全長，軟體分析其基因結構，進行進化與組織特異分析，並確定2種蛋白是否定位於蘋果花柱TTc或花粉管膜上，通過藥物阻斷實驗初步證明轉運蛋白作用，再利用RNAi技術將由花粉和花柱特異性啟動子構建的2種蛋白基因載體導入雜交矮牽牛中，沉默膜對應基因，通過分析轉基因矮牽牛異花授粉後2種轉運蛋白及S核酸酶在花柱細胞和花粉管內的表達，從而揭示蘋果花柱S核酸酶跨膜轉運機制。
結題摘要
蘋果等薔薇科果樹中存在由S基因座控制的配子體自交不親和現象，S基因座主要包括S-RNase和F-box。SI反應的發生主要是由花柱S-RNase進入花粉管發揮細胞毒性作用阻止自我花粉管生長引起的生殖隔離現象。因此，花柱產生的S-RNase如何進入花粉管就成為一直以來研究中的謎團。本項目在前期基礎工作中，通過以S-RNase為誘餌，利用酵母雙雜交篩選，從蘋果國光‘花粉’cDNA文庫中獲得了一個具有跨膜轉運功能的ABC基因片段，推測其可能與S-RNase運輸機制相關。因此，圍繞蘋果S-RNase跨膜轉運機制，我們對ABC蛋白進行了結構分析、生化性質、轉運功能研究及轉基因驗證，終於揭開了蘋果ABC跨膜轉運蛋白在骨架協同作用下運送S-RNase至花粉管囊泡導致自交不親和反應的謎團，主要研究結果如下： 1.蘋果花粉ABC基本性質分析。酵母轉化和pull-down驗證了ABC與S-RNase互作；NCBI保守域CD-Search分析將其命名為MdABC；RT-PCR表明花粉中其表達量最高；花粉基因槍法將其轉入‘國光’花粉及利用PEG轉化玉米原生質體，均顯示其在細胞質膜上表達。 2.證明ABC能夠影響蘋果花粉管對S-RNase的運輸。反義寡核苷酸轉染沉默花粉MdABC表達，發現添加S-RNase培養花粉管後，花粉生長長度顯著高於未沉默ABC的對照；利用FITC-S-RNase培養花粉，發現S-RNase螢光點在花粉管內，但沉默MdABC表達的花粉管內未觀察到。 3.S-RNase的運輸不具有S單元型特異性。酵母雙雜證明ABC與不同S單元型核酸酶互作；添加FITC-S1、RBITC-S2-RNase培養蘋果自交後代純合體花粉，在沉默MdABC表達花粉管內觀察不到S-RNase螢光點。 4.花粉管細胞骨架對於S-RNase運輸起重要作用。利用微絲、微管相關藥品與S-RNase同時處理花粉管，萌發和生長長度均顯著高於對照花粉管。利用FITC-S-RNase培養微絲藥品處理後的花粉管，發現花粉管內少見S-RNase螢光點；自交授粉發現Taxol處理的花粉在花柱中的生長長度遠高於對照。 5.矮牽牛轉基因實驗驗證了ABC對自交親和性影響。葉盤法轉基因將過表達ABC及沉默PhABC載體轉入自交不親和矮牽牛，發現僅沉默ABC的矮牽牛能夠打破原有自交不親和性。
