藥物敏感試驗

藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨床合理選用抗生素藥物的微生物學試驗。

一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。反之，則稱為“不敏感”或“耐藥”。為了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用藥，減少盲目性，往往應進行藥敏試驗。其大致方法是：從病人的感染部位採取含致病菌的標本，接種在適當的培養基上，於一定條件下培養；同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面（或用不鏽鋼圈，內放定量抗生素溶液），培養一定時間後觀察結果。由於致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關係。於是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、準確。目前濫用抗生素，致使抗藥菌增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，殺傷體內正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂“二次感染”的情況屢有發生，給治療造成人為的困難。因此，提倡使用藥敏試驗，堅持合理用藥十分重要。

基本介紹

• 中文名：物敏感試驗
• 簡稱：藥敏試驗
• 或稱：耐藥試驗
• 旨在：了解病原對抗生素的敏感程度

試驗介紹

藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨床合理選用抗生素藥物的微生物學試驗。

試驗方法

目前常用的藥敏試驗方法有：紙片瓊脂擴散法（K-B法）、稀釋法、E試驗、檢測細菌耐藥性的方法。稀釋法分液體稀釋法和瓊脂稀釋法。檢測細菌耐藥性的方法包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測、耐萬古黴素腸球菌（VER）的檢測、耐青黴素肺炎鏈球菌（PRP）的檢測、超廣譜β-內醯胺酶（ESBL）的檢測和β-內醯胺酶的檢測。

實驗步驟

實驗材料

1.1普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。

1.2藥敏試紙：購買或自製（詳見實驗準備）

1.3細菌：待做藥敏試驗的細菌

1.4接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯

1.5移液器、滴頭

實驗準備

2.1藥敏片的準備：購買或自製

2.1.1藥敏片的製備：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鐘高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。

2.2.2抗菌藥紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期3-6個月。各種常用藥的藥液配製詳見表-2

2.2藥液的製備（用於商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配製藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做藥敏試驗的藥液。

實驗操作

3.1藥敏片法

3.1.1在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）

3.1.2將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分布於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。

3.1.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

3.2牛津杯法

3.2.1在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）

3.2.2以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘後，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。

3.2.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

3.3打孔法：該法較簡單，成本低，易操作，比較適用於商品藥物的檢測。

3.3.1在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）

3.3.2以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。

3.3.3加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。

3.3.4將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

結果觀察

在塗有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養後形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關係。

判定標準

1.藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

表—1藥物敏感實驗判定標準

抑菌圈直徑（毫米）敏感度

20以上極敏

15—20高敏

10—14中敏

10以下低敏

0不敏

2.藥物敏感實驗判定標準參考表—1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。

影響結果因素

培養基

應根據試驗菌的營養需要進行配製。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應儘量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

細菌接種量

細菌接種量應恆定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

藥物濃度

藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配製。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配製。

培養時間

一般培養溫度和時間為37℃8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰櫃內2-4小時，使抗菌藥預擴散，然後再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。

套用

藥物敏感實驗後，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。