藥物外排泵(efflux pumps)是存在於細菌細胞膜上的一類蛋白質。研究發現,許多細菌可以通過外排泵系統將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外,從而使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥。
1 藥物外排泵的生理功能,2 藥物外排泵作用機制,3. 藥物外排泵轉運機制,
藥物外排泵(efflux pumps)是存在於細菌細胞膜上的一類蛋白質。研究發現,許多細菌可以通過外排泵系統將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外,從而使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥。
1 藥物外排泵的生理功能
外排系統的首要功能與細胞的正常物質轉移和代謝有關,外排抗生素等毒性物質只不過是其次要和偶然的功能。vanAubel等在人腎近曲小管中發現的MRP4 是一個轉運cAMP和cGMP的外排泵,而cAMP和cGMP對於細胞信號和體液平衡十分重要。在銅綠假單胞菌中存在一種mexA-mexBoprM編碼的外排泵,該外排泵能對銅綠假單胞菌中的細胞與細胞間通訊相關信號分子3OC12-HSL外排。ABC型的轉運蛋白TAP1及TAP2可以轉運抗原肽通過內質網,並在抗原加工的過程中起了關鍵的作用。此外,質子依賴型外排泵Nramp1 (Slc11a1)可以將吞噬溶酶體和巨噬細胞溶酶體中的Fe和Mn轉運到胞質溶膠,使溶酶體或吞噬體中的致病菌沒有足夠的Fe和Mn維持正常的生命活動, 達到清除致病菌的目的。巨噬細胞的外排泵系統能將內醯胺類(lactam)、氟喹諾酮類(fluoroquinolones)、大環內酯類(macrolides)、四環素類(tetracycline)、林可醯胺類(lincosamide)和利福黴素(rifamycin)等排出,使吞噬細胞中的抗生素濃度降低到最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration MIC)以下,使致病菌在吞噬細胞中存活。Rudin等[ 10] 用外排泵抑制劑吉非貝齊(gemfibrozil)作用於J774巨噬細胞,提高了氟喹諾酮類藥物對胞內致病菌Listeriamonocytogenes的殺傷能力證實了這一點。但目前對於外排泵的研究主要集中於其對細菌耐藥性的作用方面。
2 藥物外排泵作用機制
2.1 SMR家族 通過定點突變確定了SMR家族可能的轉運機制:①藥物與帶電荷殘基的質子交換。②通過一系列構象改變來驅動藥物通過疏水通道進行轉位。③在外部培養基中用質子代替藥物來恢復起始構象。轉運的結果是藥物和質子的交換。SMR中與質子交換相關的殘基可能是一個谷氨酸。SMR家族轉運蛋白較小,只有約110個胺基酸殘基,通常包括4個跨膜區,前三個跨膜區包含許多保守的胺基酸,這些胺基酸殘基的側鏈與底物疏水區作用而運輸底物。
2.2 MFS家族 MFS家族既有特異性的藥物外排泵,也有多重藥物外排泵,這體現了該家族底物特異性在進化上的反覆,革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的MFS族外排泵的外排模式不同。通過對胺基酸序列的分析,MFS家族中的12次跨膜家族是由一個編碼6次跨膜結構的基因重複表達而來,而且該家族存在的14次跨膜的結構是由12次跨膜結構家族插入一個疏水的中央環構成。在MFS家族也存在一些保守的基序,這些序列被認為與MFS家族的活性有關。MFS家族的藥物轉運機制與SMR相似,但是負責質子交換的殘基是一個保守的精氨酸。SMR與MFS超家族這種藥物底物與質子交換的轉運機制與其優先轉運陽離子的現象吻合。結核分枝桿菌MFS家族外排蛋白P55發揮功能需要一個脂蛋白LprG的協助。
2.3 RND家族 該家族蛋白存在於真核和原核生物中。目前研究最多的是大腸桿菌(Escherchia.coli)的AcrB蛋白, 該蛋白可以將細胞質和周質空間的一些藥物泵出細胞外, 使E.coli對多種抗生素的耐受水平提高數個數量級。AcrB包括12次跨膜的α螺旋和一個大的細胞周質域, 其主要的功能域為三聚體,由36次跨膜的α螺旋構成。細胞周質域的每個亞基的構象有些細微的不同,每個亞基都具有一個底物識別位點, 但在特定的時間只有一個位點(binding site)被底物所占據,推出位點(extrusionsite)緊鄰周質但開放於TolC對接域,將底物推入TolC外排;接入位點(accesssite)緊鄰TolC但開放於周質,準備接受底物。該三個周質域的構象由上述三個位點輪流替換,形成一個類似蠕動泵的機制將底物排出細胞外。AcrA蛋白的作用主要是促進外排體系與細胞膜的融合。
2.4 ABC超家族具有活性的ABC型外排泵至少需要兩個跨膜區及兩個核苷酸結合區。TMD通常具有6次跨膜結構,而NBD通常有3個保守的基序。通過對ABC家族的胺基酸序列的分析, 發現NBD單元具有很高的同源性,而TMD的保守性較差, 估計TMD的作用在於區分不同的底物,另外NBD與TMD的接觸方式也不一樣:有的每個NBD只接觸兩個TMDs中的1個,如BtuCD/HI1470-1亞類;有的每個NBD和兩個TMDs都有接觸, 如Sav1866和P-糖蛋白。金葡菌多重耐藥ATP結合盒轉運蛋白Sav1866的晶體結構表明處於ATP結合狀態時,兩個核苷酸結合結構域緊靠在一起,TMD則形成用於藥物轉運的中央通道,細胞質膜及脂雙層遮蓋該通道背面,另一面向細胞質外開放。當ATP結合到NBD上後,使兩個NBD靠在一起, TMDs的構象發生轉變,通過對底物親和力的改變和底物結合位點的重新定向來將底物釋放到細胞外,ATP水解和Pi及ADP釋放後,NBDs重新轉變為開放狀態,TMDs也重新恢復為起始構象。
3. 藥物外排泵轉運機制
目前關於藥物轉運體具體的機制還存在許多爭論,先後提出了不同的模型,但認同度最高的只有兩種,一種是疏水的“真空吸塵器”,另一種是“翻轉酶模式”。第1 種模型:認為藥物能自由移動到膜的脂層,接觸到轉運蛋白的中央通道,藥物從中央通道被排除,RND家族的外排泵可以使用該模型解釋;第2種模型:認為藥物自由移動到脂層並與轉運蛋白接觸,通過酶的翻轉將底物送到外膜,酶所需要的能量一般由ATP水解提供,這種模型被用來描述多種ABC型的外排泵,如人類MDR3 和MRP基因所編碼的外排泵。
目前臨床分離的許多菌株具有多重耐藥性,很難用單一的點突變來解釋。目前對於多重耐藥的機制解釋越來越傾向於多種機制的結合。藥物外排泵更容易解釋微生物的多重耐藥。藥物外排泵介導的耐藥也是目前研究的熱點之一。