《藍豬耳離體受精的探索》是依託廈門大學，由田惠橋擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：藍豬耳離體受精的探索
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：田惠橋
- 依託單位：廈門大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
離體受精是將分離的精、卵細胞置於離體控制條件下進行體外融合，形成合子，再將人工合子培養成再生植株的實驗系統。它不僅排除了體細胞組織對受精過程研究的障礙，而且還提供了直接觀察雌、雄配子受精和受精後合子發育動態的技術平台，是研究高等植物受精和早期胚胎髮生機制的有效方法。高等植物的離體受精目前僅在玉米和水稻兩種單子葉植物中獲得成功。藍豬耳（Torenia fournieri）的胚囊部分裸露，對它的卵細胞分離工作相對較容易。在我們已成功地分離出藍豬耳卵細胞和精細胞的基礎上，本項目重點探索誘導藍豬耳的精、卵細胞體外融合的細胞融合技術，並建立人工合子的單細胞培養技術，創建藍豬耳的離體受精實驗體系，填補雙子葉植物離體受精實驗體系的空白。
結題摘要
藍豬耳是二胞型花粉，生殖細胞只在生長的花粉管中才分裂形成兩個精細胞。用體內-體外技術培養出花粉管後，爆破花粉管即可釋放出花粉管內含物，其中包括兩個精細胞。在顯微鏡下兩個精細胞表現出體積上的差異：其中體積較大的精細胞與花粉管的營養核相連，體積較小的精細胞不與營養核直接相連，而只與大精細胞連線。兩個精細胞之間的連線比較緊密，需用微量酶液將兩個精細胞分開，再用顯微操作儀就可分別挑選出兩個數量上百的精細胞群體。 藍豬耳胚囊部分裸露出胚珠，在光學顯微鏡下能清楚觀察到卵細胞和助細胞的形態結構。用解剖和酶解-解剖兩種方法都能分離出生活卵細胞和合子。後種方法恰當的酶濃度既能使分離更加容易操作，又對卵細胞沒有致命傷害，能在短時間內分離出較多的卵細胞和合子。在顯微鏡下觀察到分離的生活卵細胞和合子存在有差異：卵細胞的細胞質較集中，周圍有較多大小不等的液泡；合子的細胞質分布較均勻，液泡明顯少。用螢光素二醋酸酯（FDA）染色後合子細胞質的螢光強度明顯高於卵細胞。合子的體積隨著發育進展有一個收縮過程。藍豬耳卵細胞的成功分離，為研究卵細胞受精前後生物學特性及合子激活機理等有性生殖生物學問題打下基礎，也為建立藍豬耳離體受精體系創造了條件。 用體內-體外方法分離了藍豬耳精細胞。用酶解和解剖方法分離了其成熟卵細胞。分離的精、卵細胞用電融合介導嘗試了體外誘導融合。在合適的滲透壓（6%甘露醇）和合適的氯化鈣(0.04% CaCl2•2H2O)溶液中，用交流電場為30-35 V, 10-25 s使精、卵細胞排隊；用直流電場400-600 V，45-50 µs的脈衝穿孔條件可誘導30%的精、卵細胞融合和70%以上的卵細胞之間的融合。嘗試了人工合子的單細胞培養但未獲成功。誘導藍豬耳精、卵細胞融合的條件與玉米和水稻不同。
