萊茵衣藻缺硫放氫過程中的調控miRNAs及其功能研究

《萊茵衣藻缺硫放氫過程中的調控miRNAs及其功能研究》是依託深圳大學，由胡章立擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：萊茵衣藻缺硫放氫過程中的調控miRNAs及其功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：胡章立
• 依託單位：深圳大學

項目摘要

由於綠藻氫酶的活性是光合細菌和藍藻中氫酶活性的100多倍, 所以綠藻光合放氫是最具有套用前景的生物制氫途徑。然而，綠藻氫酶受光合放氧的抑制, 使得其持續放氫時間只有幾秒到幾分鐘。研究發現缺硫脅迫處理後, 綠藻持續放氫時間可達70小時，其藻細胞產氫效率大大提高。目前對這一現象的生理生化過程進行了深入研究，但其分子調控機制還不清楚。申請者研究發現miRNAs參與了萊茵衣藻應答缺硫放氫過程的調控，為探討硫脅迫下綠藻持續放氫的分子調控機制提供了新的思路。本項目擬以單細胞真核綠藻-萊茵衣藻作為實驗材料，通過分析萊茵衣藻應答硫脅迫放氫過程中miRNAs的表達譜,篩選參與調控硫脅迫放氫過程的特徵miRNAs，預測並驗證其靶基因。通過對藻細胞特徵miRNAs進行正負調控，研究其在萊茵衣藻應答硫脅迫放氫過程中的調控功能，為進一步探討綠藻生物光合制氫的分子調控機制提供重要的理論依據。

結題摘要

由於綠藻氫酶的活性是光合細菌和藍藻中氫酶活性的100多倍, 所以綠藻光合放氫是最具有套用前景的生物制氫途徑。然而，綠藻氫酶受光合放氧的抑制, 使得其持續放氫時間只有幾秒到幾分鐘。研究發現缺硫脅迫後, 綠藻持續放氫時間可達70小時。為了探討萊茵衣藻缺硫放氫的機制，本研究對萊因衣藻缺硫放氫過程中的調控miRNAs及其功能進行了研究，具體結果如下： （1）利用深度測序和螢光定量PCR技術，對正常培養和缺硫培養的萊茵衣藻小RNA庫進行分析，結果發現：①萊茵衣藻的小RNA長度主要分布在20nt-25nt，主要定位在萊茵衣藻第3、7、10、13號染色體的正鏈上以及萊茵衣藻第1、2、9號染色體的負鏈上；②萊茵衣藻在缺硫培養環境下，小RNA的組成有了很大的改變，siRNA的表達量基本保持穩定，而miRNA的表達量有著顯著的提升；③比較硫培養和缺硫脅迫下的萊茵衣藻miRNAs表達譜，篩選到47個衣藻miRNA參與萊茵衣藻缺硫脅迫調控。這些調控miRNAs分別涉及到脂代謝、蛋白水解、光合作用、碳代謝、轉位子和轉運體、DNA和RNA轉錄翻譯、嘌呤和嘧啶代謝、胺基酸代謝和激酶磷酸化代謝等眾多的代謝途徑。（2）採用雙向電泳和質譜技術相結合的方法，分析缺硫脅迫對萊茵衣藻蛋白表達水平的影響，發現12個有明顯表達差異的蛋白質；對OEE2基因進行了螢光定量PCR檢測，結果發現OEE2基因在缺硫培養72h後，表達量下調至正常培養的16.6%。 （3）以OEE2基因為靶點，採用高豐度萊茵衣藻cre-MIR1162的前體，構建人工microRNA表達骨架；並插入到pH124中構建人工microRNA的表達載體，轉入到萊茵衣藻並篩選到高效表達人工microRNA的轉基因藻株。（4）利用WATER- PAM、GC等分析手段對萊茵衣藻對照組和轉基因藻株的光合活性及光合放氫水平進行分析，發現通過誘導表達人工microRNA，可使轉基因藻株的PSⅡ系統受到抑制。使轉基因藻株單位產氫量比對照提高四倍以上。（5）利用構建過表達內源miRNAs的轉基因藻株，對篩選的缺硫產氫調控miRNAs進行功能分析，發現microRNA1166.1是衣藻產氫非常重要的調控miRNA。本項目的研究結果為闡述綠藻缺硫放氫的機制提供了重要的證據，為進一步開發綠藻生物光合制氫生物反應器提供了重要的理論基礎和新的技術途徑。