草地貪夜蛾中腸上皮細胞和sf9細胞Vip3A結合受體的鑑定

《草地貪夜蛾中腸上皮細胞和sf9細胞Vip3A結合受體的鑑定》是依託南開大學，由蔡峻擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：草地貪夜蛾中腸上皮細胞和sf9細胞Vip3A結合受體的鑑定
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蔡峻
• 依託單位：南開大學

中文摘要

蘇雲金芽孢桿菌( Bacillus thuringiensis , Bt)毒素與受體的結合是影響毒力的關鍵。目前，已知的Cry類蛋白受體主要有氨肽酶N，類鈣粘蛋白、鹼性磷酸酶和糖脂等。現已有成功利用受體與Cry類蛋白相互作用的機理來提高毒力，延緩抗性的報導。Vip3A因其獨特的殺蟲機理和廣譜的殺蟲活性而被譽為第二代殺蟲蛋白, 但其受體尚不清楚。本項目擬採用對Vip3A敏感的草地貪夜蛾中腸上皮細胞和sf9細胞來篩選鑑定Vip3Aa的受體。包括: （1）套用蛋白質組學技術鑑定與Vip3A蛋白結合的細胞膜蛋白；（2）克隆、表達純化結合的膜蛋白（3）在體外套用配體印跡技術，Pull-down技術驗證；（4）在體內套用RNAi技術和雷射共聚焦掃描顯微鏡技術鑑定篩選到的蛋白是否就是受體。本項目為揭示Vip3Aa的殺蟲機理提供新的科學依據；同時在提高Bt毒力，延緩抗性方面有著極大的指導意義和套用價

結題摘要

蘇雲金芽胞桿菌分泌的營養期殺蟲蛋白Vip3A被稱為第二代殺蟲蛋白，與殺蟲晶體蛋白（Cry）沒有同源性，殺蟲機理也不相同。但Vip3A殺蟲機理的研究要遠遠落後於Cry蛋白。迄今為止，還未見Vip3A確定受體的報導。 本項目研究通過套用流式細胞儀技術，DNA片段化分析等技術手段，首次證實Vip3A能夠誘導sf9細胞發生凋亡，並且這種凋亡與線粒體膜電勢的變化以及Caspase信號傳導相關。在此基礎上，我們開展了Vip3A受體的篩選鑑定研究。首先，採用親和磁珠法，將釣取到的能與Vip3Aa結合的膜蛋白進行液相色譜-串聯質譜分析（LC-MS/MS）。 質譜分析共檢測到70種蛋白，包括29種核糖體蛋白(其中包括辛格等人發現的Vip3A的伴侶蛋白)和41種其他類型的蛋白（包括清道夫C型受體Sf-SR-C）和成纖維細胞生長因子受體(FGFR) 。由於Sf-SR-C和FGFR是膜蛋白，我們的研究重點也圍繞它們展開。 （1）體外實驗（親和磁珠釣取實驗，免疫共沉澱實驗和Pull-down實驗）一致證實Sf-SR-C能與Vip3A結合；（2）體內實驗，我們發現Vip3Aa能夠與sf9細胞的Sf-SR-C共定位，並且在果蠅S2細胞中異源表達的Sf-SR-C也能與Vip3Aa共定位；（3）通過RNAi技術下調甜菜夜蛾的清道夫C型受體的表達後，Vip3A對這些幼蟲的毒力明顯下降；（4）在果蠅幼蟲中場中異源表達Sf-SR-C，轉基因的果蠅幼蟲變得對Vip3Aa敏感；（5）進一步研究表明，Sf-SR-C胞外部分的CCP結構域和MAM 結構域與Vip3Aa的結合密切相關；（6）通過4類9種特異性抑制劑的使用，我們顯示Vip3A能通過一種依賴於發動蛋白、與巨胞飲相關的內吞方式進入胞內，並且通過螢光免疫方法和競爭結合的方法證實，Vip3A蛋白的這種內吞是Sf-SR-C激發的。 我們的結果首次揭示Sf-SR-C是Vip3A的特異受體，從分子水平解釋了Vip3A殺蟲特異性和作為生物殺蟲劑的安全性。更重要的是，我們的結果顯示Vip3A的殺蟲機理與 Cry蛋白“穿孔”模型以及新提出的“壞死”模型不同，對Vip3A的理論研究和實際套用都會有顯著地促進作用。 通過體內外實驗，我們還發現FGFR也是Vip3A的受體。Sf-SR-C和FGFR這兩類受體如何在殺蟲過程中同時或者先後發揮作用，需要我們進行深入研究。