《苜蓿中華根瘤菌NtrY/NtrX雙組份系統的作用機制研究》是依託上海大學，由羅利擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：苜蓿中華根瘤菌NtrY/NtrX雙組份系統的作用機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：羅利
- 依託單位：上海大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
雙組份系統是根瘤菌進行共生固氮作用的主要調節系統。NtrY/NtrX雙組份系統最早發現於田菁根瘤菌,是結瘤、固氮所必需的。但其作用機制並不清楚。我們的研究發現，該系統還調節苜蓿中華根瘤菌胞外多糖合成、運動以及細胞分化，具有多功能性。其可能的分子機制有兩種：1、NtrY組氨酸激酶同時磷酸化多種反應調節蛋白；2、NtrX反應調節蛋白同時激活多個下游靶標基因表達。為了檢驗這兩種可能性，本項目擬套用磷酸化譜技術，結合細菌雙雜交和免疫共沉澱，分離鑑定可以被NtrY直接磷酸化的蛋白質；套用轉錄組學與染色質免疫共沉澱技術，鑑定NtrX直接調節的下游靶標基因，並通過實時定量RT-PCR、啟動子融合以及凝膠阻滯技術，驗證獲得的結果，從而揭示NtrY/NtrX雙組份系統多功能性的分子機制。本項目對於闡明共生固氮作用的分子機制以及揭示細菌雙組份系統信號傳遞保真性及可塑性具有重要的理論意義。
結題摘要
雙組份系統主要由組氨酸激酶和反應調節蛋白組成，是根瘤菌進行共生固氮作用的主要調節系統（如FixL/FixJ和DctB/DctD等）。NtrY/NtrX雙組份系統最早發現於田菁根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）,是結瘤固氮所必需的。但其作用機制並不清楚。在本項目中，我們套用遺傳學和生物化學方法系統地研究了模式根瘤菌——苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）NtrY/NtrX雙組分系統的功能及其作用機制。通過創製ntrY基因的缺失突變體和ntrX基因的下調（knock-down）突變體，並考察其遺傳表型，發現NtrX可以廣泛地調節多種細胞生理過程，包括胞外多糖I（EPSI，琥珀醯聚糖， succinoglycan）的生物合成、鞭毛的合成及運動、生長和共生結瘤固氮，具有多功能性；且其自身不可缺失，其蛋白分子上的磷酸化位點（D53）不可替換； NtrY不是NtrX上游唯一的組氨酸受體激酶，因為其缺失突變體在實驗條件下不影響上述細胞生理過程。套用各種組學技術（包括RNAseq和ChIPseq等）發現NtrX作為轉錄因子直接調節超過1600個下游基因的表達，包括胞外多糖合成酶基因(exo)、鞭毛蛋白及其調節基因（fla）、細胞周期有關基因（div）和胺基酸代謝基因（gln）等。據此，我們建立了一個新的NtrY/NtrX磷酸級聯傳遞系統控制細菌生理過程的工作模型：NtrY與其它組氨酸激酶分子感受環境信號，自身磷酸化，再將磷酸基團轉移給NtrX，磷酸化的NtrX直接調節下游基因（包括多個轉錄因子）的表達，從而控制多種細胞生理過程和行為。我們的研究首次揭示了NtrX反應調節蛋白多功能性的分子機制。本研究的價值：1、改變了我們對於固氮細菌雙組份調節系統信號傳遞保真性的認識。以前一直認為調節共生固氮作用的雙組份系統其組氨酸激酶和反應調節蛋白存在一一對應關係，所以信號傳導是高保真的。但是，我們的研究結果顯示一個反應調節蛋白可以對應多個組氨酸激酶即二者之間存在多對一的關係，信號傳導是動態可塑的。2、提出了新的科學問題，即在共生固氮系統中，類菌體感受宿主營養信號和控制細胞周期運行的協調機制問題。
