《芽孢桿菌B1菌株降解4-羥基苯甲酸途徑中NIH重排反應研究》是依託江蘇師範大學，由馮昭中擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：芽孢桿菌B1菌株降解4-羥基苯甲酸途徑中NIH重排反應研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：馮昭中
- 依託單位：江蘇師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
4-羥基苯甲酸（4HBA）本來是在自然界中存在的芳香族化合物，但隨著含有4HBA的工業產品的大量使用和排放，4HBA已成為常見的有機污染物。微生物降解4HBA的途徑有原兒茶酸開環途徑，鄰苯二酚開環途徑和厭氧微生物的苯環開環途徑。Bacillus sp. B1菌株是從堆肥中分離出來的嗜熱性細菌，擁有各種各樣的芳香族化合物降解途徑。B1菌株降解4HBA的途徑不同於其他常見微生物，是通過龍膽酸開環途徑。從4HBA轉化為龍膽酸的過程包括一個叫做“NIH重排”的反應。我們在前期工作中預測出有輔酶A連線酶、單加氧酶和裂解酶的參與，但是其反應機制尚不明了。本項目的研究內容是：（1）編碼NIH重排反應相關酶的基因研究；（2）各個酶促反應的熱動力學特性研究。通過這些研究徹底闡明從4HBA轉化為龍膽酸過程中的NIH重排反應全貌，並揭示在自然界中發揮的作用。
結題摘要
對羥基苯甲酸是一種在自然界中廣泛存在的芳香族化合物，也是很多天然產物和人工合成化合物的中間代謝產物。從20世紀中葉起，隨著社會的發展，石化產品的需求增加，大量的使用這些含有芳香環的石化產品，導致環境中人工化合物的積累超出了自然淨化速度，對羥基苯甲酸正是這些人工化合物降解的主要中間代謝產物之一。對羥基苯甲酸的微生物降解一直受到環境工作者的關注。本課題組從堆肥中分離出一個嗜熱性芽孢桿菌D1菌株，能夠降解包括對羥基苯甲酸在內的各種低分子芳香族化合物。在降解對羥基苯甲酸的過程中龍膽酸作為中間代謝產物被檢測出來。從對羥基苯甲酸轉化為龍膽酸的過程包含1位的羧基移位到鄰位的反應，該反應與一個叫做NIH重排的反應非常類似，但詳細反應機制尚不明了。本研究將從代謝產物、酶、基因的水平闡明NIH重排反應機制。 為了推測NIH重排反應機制，利用粗酶做了一系列實驗。以對羥基苯甲酸作為唯一碳源培養B1菌株，當對羥基苯甲酸消耗一半時，收集菌體，破碎細胞後作為粗酶使用。對羥基苯甲酸作為反應底物，在含有粗酶的反應溶液中加入CoA，ATP和Mg2+ 時，利用分光光度計檢測到332 nm波長有吸收。在以上反應液中再加入NADPH後，332 nm的吸收消失，利用氣質聯用色譜檢測到龍膽酸的生成。以上實驗結果表明從對羥基苯甲酸到龍膽酸的NIH重排反應至少包含有CoA連線酶，單加氧酶，和裂解酶催化的反應。另外本研究還對龍膽酸降解途徑進行了研究，推測出一個由龍膽酸雙加氧酶、異構酶和水解酶參與的代謝途徑，該途徑將龍膽酸降解到延胡索酸和丙酮酸。 為了克隆NIH重排反應相關基因，本研究對D1菌株的基因組進行了測序和注釋。B1菌株的基因組大小為3,640,549 bp，預測出2,810個基因。其中編碼CoA連線酶基因有20個，單加氧酶基因有10個，裂解酶基因16個，龍膽酸雙加氧酶基因有7個。這些基因是否參與對羥基苯甲酸的降解以及NIH重排反應進行了初步研究。
