《艱難梭菌毒素B(TcdB)受體蛋白的篩選及功能鑑定》是依託北京大學，由魏文勝擔任負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：艱難梭菌毒素B(TcdB)受體蛋白的篩選及功能鑑定
- 項目負責人：魏文勝
- 依託單位：北京大學
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
艱難梭菌(Clostridium difficile)通過分泌兩種毒素蛋白（TcdA/B）致病，是全球範圍導致抗生素相關腹瀉和假膜結腸炎的主因。作為嚴重威脅公共生命安全的感染性疾病，艱難梭菌通過毒素侵染的機制還不十分清楚，這嚴重阻礙了有效治療手段的研發。TcdB被證明是艱難梭菌致病的主要原因，而且它是通過受體介導進入到宿主細胞內部致病的，然後人們對該毒素受體幾十年的尋找至今一無所獲。我們計畫利用shRNAmir基因沉默文庫以及我們剛研發成功的基於CRISPR/Cas9系統的sgRNA基因敲除文庫（Nature 2014），篩選TcdB的宿主細胞受體蛋白。我們初步結果已經獲得候選的毒素受體，我們將使用多種手段證明尋找到的受體，以及繼續篩選鑑定存在的第二個受體。這項研究將深化人們對艱難梭菌引起的感染性腹瀉的發病機理的認識，並對發展新型治療手段提供新的藥物作用靶點。
結題摘要
艱難梭菌（Clostridium difficile）是一種厭氧的、能夠形成孢子、寄生在哺乳動物腸道中的革蘭氏陽性菌。艱難梭菌感染能夠引起結腸炎、抗生素相關性腹瀉、偽膜性腸炎甚至死亡。目前，艱難梭菌感染已經成為引起醫療相關感染的主要原因之一。艱難梭菌通過分泌兩種毒素TcdA和TcdB對宿主細胞產生毒理傷害，其中TcdB是主要的毒力因子，但是其進入細胞內的受體不清，制約致病機制研究及藥物靶點開發。 利用shRNAmir文庫篩選、TALEN及CRISPR/Cas9介導的基因敲除等多種手段，我們首次發現艱難梭菌毒素B（TcdB）受體 –Chondroitin sulfate proteoglycan 4（CSPG4），並對其在感染過程中的功能進行了完整證明及機制研究。在此基礎上，通過CRISPR篩選的方法，發現了TcdB的新受體Low density lipoprotein receptor-related protein 1（LRP1）。我們利用TALEN基因組編輯技術獲得了LRP1-/-單克隆細胞，並發現CSPG4-/-/LRP1-/-細胞與CSPG4-/-細胞相比，對於TcdB的抗性增強，Rac1的糖基化速率也減慢，表明LRP1在介導TcdB進入細胞中起到關鍵作用。免疫沉澱實驗表明全長LRP1蛋白也能夠和全長TcdB蛋白存在相互作用，並且LRP1蛋白能夠特異性地與TcdB的CROPs區域結合，提示存在雙受體介導TcdB入胞的新機制。此外，我們首次證實艱難梭菌通過激活強自噬途徑侵染宿主的機制，並闡明BECN1蛋白在細胞自噬中的獨特作用。我們還發現了TcdB的糖基轉移酶的活性能夠觸發細胞自噬介導的細胞生長抑制。 TcdB毒素是艱難梭菌感染中最為重要的致病因子，人們對其受體的尋找持續了超過三十年，我們的研究發現了CSPG4和LRP1兩類重要受體，並對其介導TcdB入胞的機制進行了深入探索，這些結果將為理解艱難梭菌感染的致病機制和治療靶點的發現提供重要依據。受該基金支持，我們還建立了一系列高通量基因編輯技術平台，包括首次建立長鏈非編碼RNA的高通量篩選技術等，為感染性疾病的功能基因組學提供了有力工具。發表與基金支持相關的SCI論文10篇，其中包括Nature Biotechnology、Cell Research、Nature Communications等高影響因子論文。
